急性早幼粒白血病耐藥細(xì)胞株靶向肽的鑒定及肽體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)M3亞型。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)與蒽環(huán)類藥物聯(lián)合使用，是新診斷APL患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，完全緩解率可達(dá)到或超過90％，治愈率接近80％。但仍有部分患者因ATRA耐藥的發(fā)生而導(dǎo)致治療最終失敗，ATRA耐藥成為APL患者診治過程中

2、需要解決的關(guān)鍵問題之一。
　　多肽免疫原性弱、組織滲透性好和半衰期短等特點(diǎn)是其成為疾病體內(nèi)診斷及靶向治療制劑的有利因素，目前人們利用噬菌體展示文庫篩選技術(shù)(Phage display technology)已獲得多種腫瘤的靶向多肽，并成功用于疾病的特異性診斷及治療。在多肽基礎(chǔ)上構(gòu)建的肽體指由多肽與免疫球蛋白IgG的Fc段鉸鏈區(qū)融合而成的蛋白，肽體保持了多肽與靶分子的結(jié)合特異性，同時兼具免疫球蛋白的半衰期長及具有細(xì)胞毒性、生產(chǎn)簡易、

3、易于純化，已經(jīng)在生物制藥領(lǐng)域，尤其是在抗癌藥物領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，目前已有許多肽體結(jié)構(gòu)藥物處于臨床不同階段研究當(dāng)中。
　　本實驗室前期采用濃度遞增間歇誘導(dǎo)法，對急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL-60進(jìn)行體外誘導(dǎo)篩選，獲得相應(yīng)耐藥細(xì)胞株，命名為HL-60R。之后采用基于微流控的噬菌體展示隨機(jī)肽庫篩選技術(shù)，以HL-60細(xì)胞為負(fù)篩細(xì)胞、HL-60R細(xì)胞為正篩細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞消減篩選，獲得了四個能夠與HL-60R特異性結(jié)合的噬菌體克隆:No.

4、26、No.27、No.5R5、No.5R13，展示的外源十二肽序列分別為:pepNo.27(SPTSSFQVGTFA)、pepNo.26(TLTTHGRLFESN)、pepNo.5R5(WAITKPAPAAHP)、pepNo.5R13(TSTTFKSHLDHH)，并初步驗證了噬菌體-肽與耐藥細(xì)胞株的結(jié)合特異性。
　　在此基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)噬菌體-肽克隆展示的多肽序列進(jìn)一步合成了相應(yīng)熒光標(biāo)記多肽，驗證其細(xì)胞結(jié)合特異性，并構(gòu)建相應(yīng)肽

5、體。獲得的主要試驗結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)噬菌體-肽克隆No.26、No.27、No.5R5、No.5R13的外源插入序列，委托公司合成相應(yīng)的熒光標(biāo)記多肽。為了使人工合成多肽與相應(yīng)噬菌體多肽保持一致的空間構(gòu)像，我們在人工合成多肽的羧基端增加GGGSK序列以模擬噬菌體PⅢ蛋白的游離末端，并于賴氨酸上偶聯(lián)熒光素5-TAMRA，合成相應(yīng)的熒光標(biāo)記試驗肽及對照肽(GGGAGGGAGGGAK)。流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，四種試驗肽均

6、與HL-60R細(xì)胞特異性結(jié)合，且與其他腫瘤細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞無結(jié)合。競爭抑制試驗結(jié)果顯示，未偶聯(lián)熒光素的試驗肽能夠有效競爭相應(yīng)的熒光標(biāo)記多肽，進(jìn)一步證實pepNo.27、pepNo.26、pepNo.5R5、pepNo.5R13的結(jié)合特異性。pepNo.5R13與正常人外周血有核細(xì)胞不結(jié)合，提示其具備臨床應(yīng)用潛能。
　　2、根據(jù)pepNo.27、pepNo.26序列，設(shè)計并合成兩端帶有EcoRⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)的目的片段，與Eco

7、RⅠ和NcoⅠ雙酶切的pFUSE-hIgG2-Fc2質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取陽性菌落提質(zhì)粒測序。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pFUSE-hIgG2-Fc2-26，pFUSE-hIgG2-Fc2-27構(gòu)建成功，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行肽體的真核表達(dá)，收取上清，Western blot驗證肽體Peptibody-26、Peptibody-27成功表達(dá)。
　　3、生物信息學(xué)預(yù)測pepNo.27、pepNo.26、pepNo.5R

8、5、pepNo.5R13四個肽段的理化性質(zhì)及三維空間結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)檢索白血病耐藥相關(guān)分子，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫明確它們的亞細(xì)胞定位以確定候選分子在細(xì)胞膜存在表達(dá)。利用PepSite2軟件預(yù)測多肽與它們的對接情況，基于對接P值，候選靶蛋白NCAM與pepNo.5R5有對接可能(P＜0.05）。候選靶蛋白P-gp與四種靶向肽均有對接可能，結(jié)合可能性分別是pepNo.26(P=0.04336)、pepNo.27(P=0.04421)、pe

9、pNo.5R5(P=0.03271)、pepNo.5R13(P=0.02861)。候選靶蛋白Bcl-2與pepNo.26、pepNo.5R5和pepNo.5R13具有結(jié)合可能，結(jié)合可能性分別是pepNo.26(P=0.02514)、pepNo.5R5(P=0.008697)和pepNo.5R13(P=0.03774)。
　　綜上所述，本研究根據(jù)前期篩選獲得的噬菌體克隆展示外源多肽序列，合成了四個熒光基團(tuán)5-TAMRA標(biāo)記的相應(yīng)多肽