大鼠心臟微血栓的多模態(tài)靶向分子成像研究.pdf

1、動脈血栓形成是在急性缺血性心腦血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制，最近研究表明微血栓形成在心血管疾病中同樣扮演著重要角色。但目前臨床缺乏微血栓的檢測手段，本研究評估了基于納米顆粒的冠脈微血栓多模態(tài)靶向分子顯像的可行性。
　　在評價SPIO致凝性基礎(chǔ)上，利用SPIO作為載體連接CREKA分子短肽及IR783熒光探針，構(gòu)建SPIO-CREKA納米顆粒，并在體外試驗驗證了SPIO-CREKA對纖維蛋白的靶向結(jié)合能力。體內(nèi)試驗中，利用心臟缺血再灌注方

2、法成功構(gòu)建大鼠心臟微血栓模型，靜脈注射SPIO-CREKA后，成功實現(xiàn)心臟微血栓的多模態(tài)分子顯像（MRI及活體光學(xué)顯像）。
　　第一部分:SPIO體外致栓性的研究
　　目的:通過探討體外不同濃度50 nmSPIO的致栓性，評價其作為藥物載體的安全性。
　　方法:以PBS為對照組，將0.02 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml濃度的SPIO與血漿或全血在體外共孵育，檢測血小板聚集率、凝血功能、血凝塊質(zhì)量及

3、血栓彈力圖。
　　結(jié)果:(1) PBS組、0.02 mg/ml SPIO組、0.1 mg/ml SPIO組及0.5 mg/ml SPIO組血小板聚集率分別為67.3±5.9％、68.3±4.5％、66.2±5.5％及69.5±5.9％(P＞0.05);(2)4組的APTT值分別為28.1±2.7 S、28.5±2.4 S、28.2±2.5 S及29.1±3.6S(P＞0.05)，PT值和TT值各組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

4、(3)血栓彈力圖各參數(shù)(反應(yīng)凝血功能的R時間、反應(yīng)纖維蛋白原功能的K時間及α角、反應(yīng)血小板功能的MA值、凝血綜合指數(shù)CI)，各組間比較差異均無顯著性(P＞0.05)。(4)4組的血凝塊質(zhì)量分別為759.6±38.7 mg、758.8±47.2 mg、769.8±39.2mg和766.8±40.8mg，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:50 nmSPIO在一定濃度范圍內(nèi)(0.02mg/ml-0.5mg/ml)對血小板

5、聚集、凝血功能、血凝塊質(zhì)量及血栓彈力圖均無明顯影響，表明其無致栓性，血液相容性較好，可較為安全的應(yīng)用于血栓性疾病的研究。
　　第二部分 SPIO-CREKA的制備及表征
　　目的:構(gòu)建可靶向纖維蛋白的多功能熒光磁性納米體系，用于微血栓的多模態(tài)檢測，并檢測該磁性納米體系的表征及體外致栓性。
　　方法:將熒光探針與SPIO連接后，PEG修飾SPIO，并通過Maleimide-PEG與CREKA共價結(jié)合，得到IR783-R-

6、SPIO-CREKA。通過動態(tài)光散射法檢測SPIO-CREKA粒徑、粒徑分布寬度以及表面膜電位，透射電鏡觀察粒子形態(tài)。分別使用紫外分光光度法、熒光分光光度法、紫外分光光度法及高效液相色譜法檢測IR783、rhodamine、PEG及CREKA連接效率。通過不同濃度SPIO-CREKA與血漿共孵育，檢測其對凝血功能及血小板聚集率的影響，評估SPIO-CREKA致栓性。
　　結(jié)果:SPIO-CREKA粒徑分布集中(PDI＜0.25)，

7、粒徑集中分布在1OOnm左右，電位在-2.2mv左右。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SPIO-CREKA中間為一直徑為10-20nm密度較大的磁核，外面被一層葡聚糖包裹。每個SPIO磁珠表面連接有300IR分子、1500個Rhodamine分子、6000個PEG分子及2000 CREKA分子，可有效地利用熒光顯微鏡、活體成像等技術(shù)檢測SPIO在大鼠體內(nèi)的分布。不同濃度SPIO-CREKA對APTT、PT、TT及血小板聚集率無明顯影響(各組間比較P＞0

8、.05)，其致凝性較低，可安全的應(yīng)用于體內(nèi)微血栓的靶向顯像。
　　結(jié)論:本研究利用多功能SPIO為載體，攜載近紅外熒光探針及靶向纖維蛋白分子CREKA，構(gòu)建了可對血栓性疾病進(jìn)行多模態(tài)無創(chuàng)顯像（MRI及活體光學(xué)顯像）納米體系，該納米體系表面熒光探針及CREKA密度高，致栓性低，可安全的應(yīng)用于微血栓多模態(tài)成像的研究。
　　第三部分大鼠心肌缺血再灌注后微血栓的表達(dá)及其機(jī)制的初步研究目的:檢測大鼠心肌缺血再灌注24h后是否有微血栓的

9、形成及其主要成分，并對微血栓產(chǎn)生機(jī)制做初步探討。
　　方法:制作大鼠心肌缺血再灌注模型，通過即刻心電圖描記及心超、心臟組織病理學(xué)檢測評價模型成功性，通過對纖維蛋白免疫熒光染色觀察微血栓的形成及分布，通過透射電鏡檢測確定微血栓主要成分，通過對缺血局部心肌TF及PAI-1免疫組化染色，初步探討微血栓形成的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:大鼠心肌缺血再灌注24h后，I/R組大鼠左室前壁左前降支供血范圍內(nèi)可見纖維蛋白沉積，而左室后壁、右室及s

10、ham組大鼠心臟內(nèi)均未見纖維蛋白表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察可見纖維蛋白網(wǎng)羅血細(xì)胞在小血管內(nèi)形成微血栓。透射電鏡觀察可見微血栓的主要成分為纖維蛋白、血小板及紅細(xì)胞。I/R組大鼠缺血心肌局部較sham組大鼠反應(yīng)TF及PAI-1升高。
　　結(jié)論:大鼠心肌缺血再灌注24h后缺血局部有微血栓形成，其成分包括纖維蛋白、血小板及紅細(xì)胞。心臟缺血局部TF及PAI-1表達(dá)升高，提示心肌缺血局部凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)失平衡可能是導(dǎo)致微血栓形成的原因之一。

11、
　　第四部分:大鼠心肌缺血再灌后微血栓的多模態(tài)顯像
　　目的:檢測IR783標(biāo)記的SPIO-CREKA對纖維蛋白的靶向能力，對大鼠心臟微血栓進(jìn)行多模態(tài)分子顯像。
　　方法:通過SPIO-CREKA與纖維蛋白栓子共孵育，分別通過熒光顯微鏡、光學(xué)活體成像系統(tǒng)及MRI成像系統(tǒng)體外驗證SPIO-CREKA與纖維蛋白的靶向結(jié)合能力及對血栓的成像能力;制作大鼠心肌缺血再灌注模型，尾靜脈注射PBS、SPIO-PEG及SPIO-CR

12、EKA，并使其循環(huán)4h，通過心臟組織學(xué)檢查及電鏡觀察驗證SPIO-CREKA體內(nèi)與微血栓靶向結(jié)合能力，通過MRI及光學(xué)成像系統(tǒng)檢測SPIO-CREKA對微血栓的靶向多模態(tài)分子顯像能力，并通過器官離體成像研究SPIO-CREKA在各組織的分布。
　　結(jié)果:(1)體外試驗中，熒光顯微鏡觀察SPIO-CREKA組在纖維蛋白栓子表面可見紅色熒光，而PBS組及SPIO-PEG組均無明顯熒光;在活體成像下觀察血栓凝塊可見SPIO-CREKA組

13、熒光強(qiáng)度為SPIO-PEG組的7.5倍，P＜0.001;MRI成像中，SPIO-CREKA組在MRI顯示為低信號，信號值為（66.4±13.7），而SPIO-PGE組信號改變不明顯，為（201.8±11.0），PBS組信號值為（210.9±17.2），SPIO-CREKA組與SPIO-PEG組及PBS組比較，P＜0.001。(2)在大鼠心臟缺血再灌注24h后，心臟局部微血栓形成模型中，大鼠接受尾靜脈注射相應(yīng)納米材料4h后進(jìn)行磁共振顯像。

14、SPIO-CREKA組大鼠心臟左室前壁損傷區(qū)在T2加權(quán)像是顯示為低信號，LVAM相對信號強(qiáng)度為(0.65±0.07)，SPIO-PEG組為（0.95±0.08），PBS組為（0.99±0.11），SPIO-CREKA組與其相比，P＜0.01，sham組接受SPIO-CREKA其LVAM相對信號強(qiáng)度為（0.92±0.06）。心臟離體光學(xué)成像示:SPIO-CREKA組心臟局部熒光強(qiáng)度是SPIO-PEG組的1.95倍（1.88±0.5×107

15、vs.0.96±0.09×107，P＜0.001），PBS組熒光強(qiáng)度為0.99±0.1×107，sham+SPIO-CREKA組熒光強(qiáng)度為0.94±0.1×107。SPIO-CREKA及SPIO-PEG主要分布在肝臟及腎臟內(nèi)，連接CREKA并未改變SPIO組織分布。心臟組織學(xué)檢測:大鼠I/R后組織切片共聚焦發(fā)現(xiàn)，SPIO-CREKA組SPIO-CREKA結(jié)合在微血栓表面，而PBS組及SPIO-PEG組未見明顯紅色熒光。電鏡觀察提示血管壁