惡性腫瘤靶向性多肽的篩選及在分子靶向治療中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景與目的：
　　 惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方式有手術(shù)治療、放療和化療。由于腫瘤早期即可發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，治療效果差，直接影響患者的生存率。而腫瘤分子靶向治療作為第四種全新的惡性腫瘤生物治療模式，在現(xiàn)代惡性腫瘤綜合治療中發(fā)揮了重要的作用，成為當(dāng)今腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和主題。分子靶向治療具有高效、安全、低毒的特點(diǎn)，成為提高患者生活質(zhì)量的強(qiáng)有力的手段。腫瘤分子靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)選擇性

2、地運(yùn)送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應(yīng)盡量限定在特定的靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法。因此，本課題采用細(xì)菌鞭毛隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原VEGFR-3的靶向性多肽的篩選，另一方面，利用我室已獲得的一段可特異性的靶向惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的導(dǎo)向肽TMP1，進(jìn)行TMP1-sTRAIL及TMP1-白喉毒素的重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性，為進(jìn)一步研究惡性腫瘤的靶

3、向性多肽在腫瘤分子靶向治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原VEGFR-3的靶向性多肽：利用細(xì)菌鞭毛肽庫(kù)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原VEGFR-3的胞外區(qū)蛋白和人的IgG蛋白進(jìn)行四輪正負(fù)篩選；免疫熒光法體外驗(yàn)證特異性與VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞親和的細(xì)菌克隆，獲得重復(fù)性多肽序列；化學(xué)合成TMVP1肽，免疫熒光法驗(yàn)證其與多種惡性腫瘤細(xì)胞的特異性親和力；ELISA方法檢測(cè)TMVP1與VE

4、GFR-3蛋白的親和性；構(gòu)建荷瘤小鼠模型，體內(nèi)驗(yàn)證TMVP1肽對(duì)VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性腫瘤的靶向性。
　　 2．重組腫瘤導(dǎo)向肽TMP1-sTRAIL的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性：利用PCR技術(shù)，構(gòu)建TMP1與人腫瘤壞死因子凋亡配體(胞外區(qū)114—281)的融合基因，并將該DNA片段克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS—PAGE鑒定重組蛋白為

5、包涵體后，超聲破碎細(xì)胞，尿素溶解包涵體，經(jīng)Ni2+-NTA金屬親和層析柱分離純化，獲得重組蛋白，純化產(chǎn)物的純度用SDS—PAGE和Western blot進(jìn)行鑒定。利用透析復(fù)性的方法對(duì)得到的融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，并濃縮。
　　 3．重組腫瘤導(dǎo)向肽TMP1-白喉毒素DT391的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性：利用PCR技術(shù)，構(gòu)建TMP1與白喉毒素的酶活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)(N端386—391個(gè)氨基酸，DT391)的融合基因，并

6、將該DNA片段克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS—PAGE鑒定重組蛋白為包涵體后，超聲破碎細(xì)胞，尿素溶解包涵體，經(jīng)Ni2+-NTA金屬親和層析柱分離純化，獲得重組蛋白，純化產(chǎn)物的純度用SDS—PAGE和Western blot進(jìn)行鑒定。利用透析復(fù)性的方法對(duì)得到的融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，并濃縮。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過(guò)細(xì)菌鞭毛肽庫(kù)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原

7、VEGFR-3的胞外區(qū)蛋白進(jìn)行四輪正負(fù)篩選，獲得了若干能與VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞親和的細(xì)菌克隆；通過(guò)免疫熒光法體外驗(yàn)證，篩選到一段4肽序列(ABDE)，命名為“TMVP1”；免疫熒光法的體外驗(yàn)證再次證實(shí)，TMVP1肽對(duì)VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞有很好的親和作用，而對(duì)不表達(dá)VEGFR-3的細(xì)胞無(wú)識(shí)別，序列隨意重新排列后的錯(cuò)序肽對(duì)照與VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞無(wú)親和作用，說(shuō)明TMVP1肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和作用是具有特異性的；

8、ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TMVP1對(duì)VEGFR-3蛋白的親和力隨著TMVP1濃度的升高而增強(qiáng)，但錯(cuò)序肽并無(wú)類似的變化；此外，TMVP1肽對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有很好的靶向性。TMVP1肽體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TMVP1肽對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌PC-3M-1E8及高轉(zhuǎn)移潛能的MDA-MB-435S乳腺癌均具有很好的靶向能力，序列隨意重新排列后的錯(cuò)序肽對(duì)腫瘤無(wú)靶向作用。
　　 2．成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體TMP1-sTRAIL/pET-28a，

9、，誘導(dǎo)后可表達(dá)相對(duì)分子量約為22KD的目的蛋白，占菌體蛋白的30％左右，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性、純化后可得到純度大于95％的TMP1-sTRAIL重組蛋白，并通過(guò)透析復(fù)性的方法，獲得了一定數(shù)量的活性蛋白TMP1-sTRAIL。
　　 3．成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體TMP1-DT391/pET-28a，誘導(dǎo)后可表達(dá)相對(duì)分子量約為46KD的目的蛋白，占菌體蛋白的20％左右，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性、純化后可得到純度大于90％的TMP1-DT391重組蛋

10、白，并通過(guò)透析復(fù)性的方法，獲得了一定數(shù)量的活性蛋白TMP1-DT391。
　　 結(jié)論：
　　 1．通過(guò)肽庫(kù)技術(shù)篩選獲得了TMVP1肽，可作為一種腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的靶向性多肽，如偶聯(lián)上顯影劑或抗腫瘤藥物，有望開(kāi)發(fā)成一類新型惡性腫瘤診斷和治療制劑，用于腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷、早期治療。
　　 2．構(gòu)建了TMP1-sTRAIL/pET-28a，、TMP1-DT391/pET-28a原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了相關(guān)重組蛋白的表