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抗炎藥物篩選與新型娃兒藤堿衍生物NK-007在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中作用機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性的炎癥性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,它能影響任何具有滑膜結(jié)構(gòu)的可動關(guān)節(jié)處的關(guān)節(jié),盡管發(fā)病部位更加傾向于手的腕關(guān)節(jié)和小關(guān)節(jié)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的典型自然史是進程性的關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形和失去活動能力。最近,在詮釋滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷的機制方面已經(jīng)取得大量的進展。實際上,對于TNF-α在關(guān)節(jié)炎癥和損傷中起著重要作用的認識使得治療的引入,那就是靶向TNF-α,并且對于患有關(guān)節(jié)炎病的治愈具有重要的影響。
   我們的前期工作發(fā)現(xiàn)DCB-3

2、503可以通過影響固有免疫細胞治療小鼠的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病?;谶@一現(xiàn)象,我們以DCB-3503為先導(dǎo)化合物,在此基礎(chǔ)上進行了化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾,合成了一系列的衍生物,并建立以重要炎癥因子TNF-α為靶點的藥物篩選方法。在反復(fù)實驗穩(wěn)定藥物篩選體系后,我們對多批化合物進行篩選,從中獲得了低毒高效的TNF-α的抑制劑,即NK-007。NK-007改善了原先導(dǎo)體的不穩(wěn)定性,并提高了化合物的水溶性,使其更加具有臨床應(yīng)用性。
   為驗證NK-

3、007的抗炎作用,我們在體外通過不同途徑、選擇不同細胞對其進行研究。首先使用ELISA方法檢測NK-007處理后的小鼠原代脾臟細胞以及小鼠單核-巨噬細胞系,在LPS刺激條件下TNF-α表達的改變。并分別使用流式細胞術(shù)與蛋白免疫印記對NK-007的拮抗作用進行驗證。NK-007顯著抑制小鼠原代脾臟細胞,小鼠單核.巨噬細胞系體外經(jīng):LPS刺激后TNF-α蛋白的產(chǎn)生,并且這種抑制作用呈現(xiàn)一種明顯的劑量時間依賴效應(yīng)。
   接下來,我們

4、在體內(nèi)通過建立小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(加入或不加入LPS加劇關(guān)節(jié)炎進程),進一步探討NK-007的抗炎作用。在小鼠二次免疫后不同時間點觀察關(guān)節(jié)炎發(fā)病的癥狀,在關(guān)節(jié)炎發(fā)病癥狀達到平臺期時取小鼠關(guān)節(jié)行HE染色,通過病理切片與病理評分評價NK-007的作用;并在小鼠發(fā)病急性期使用熒光定量PCR進行關(guān)節(jié)局部細胞因子表達檢測,使用免疫組化進行關(guān)節(jié)局部TNF-α表達檢測,取小鼠脾臟與引流淋巴結(jié)細胞分析小鼠免疫狀態(tài)的改變。實驗結(jié)果顯示,與對照組相比

5、,經(jīng)過NK-007治療后的關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠,其發(fā)病被阻滯或發(fā)病的癥狀顯著被減輕,發(fā)病時間延后。進一步的分析提示,NK-007抑制了關(guān)節(jié)處炎癥因子如TNF-α,IL-6以及IL-17等的表達,抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的功能,并且降低發(fā)病小鼠引流淋巴結(jié)中Th17細胞亞群的比率。
   為繼續(xù)深入的對NK-007發(fā)揮其抗炎作用的具體機制進行探討,我們對NK-007作用后的細胞進行分析。使用熒光定量PCR和熒光素酶活性

6、檢測實驗均未發(fā)現(xiàn)NK-007降低TNF-α的轉(zhuǎn)錄。通過加入ActD,我們發(fā)現(xiàn)其作用于TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性。因此,以蛋白質(zhì)印記法檢測NK-007在影響TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性信號通路中的作用,我們發(fā)現(xiàn)NK-007能夠顯著降低p38蛋白磷酸化,降低其底物MK2的表達,并進一步促進其下游效應(yīng)分子TTP的升高,后者結(jié)合于TNF-α轉(zhuǎn)錄本,使其更加容易被降解。
   為了解釋類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠體內(nèi)Th17亞群降低的現(xiàn)象,我們對NK-00

7、7處理過的樹突狀細胞進行分析,發(fā)現(xiàn)NK-007顯著下調(diào)樹突狀細胞IL-6的產(chǎn)生。這一現(xiàn)象提示我們,NK-007可以通過作用于樹突狀細胞,影響IL-6分泌從而間接抑制Th17的分化,而事實上,使用NK-007處理過的樹突狀細胞來源的上清液的確誘導(dǎo)產(chǎn)生更少量的Th17細胞。除此之外,流式細胞術(shù)檢測NK-007對Th17分化還有著直接的拮抗作用。最后,通過體外共培養(yǎng)實驗與ELISA檢測,我們發(fā)現(xiàn)NK-007能顯著降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC與

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