小檗堿合成衍生物和木豆素合成衍生物的抗炎作用研究.pdf

1、目的：
　　隨著全球人口老齡化，各種慢性病的發(fā)病率逐年增加，與之相伴是糖尿病足、放射性潰瘍、下肢靜脈潰瘍等難愈合慢性創(chuàng)面的感染也呈現(xiàn)高發(fā)率，然而難愈合慢性創(chuàng)面治療與修復(fù)仍是醫(yī)藥界和生物醫(yī)學(xué)界的難題。耐藥菌的反復(fù)感染和感染引起的持續(xù)炎癥是造成慢性創(chuàng)面難愈合的主要原因。根據(jù)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，一些同時含有抑菌和抗炎成分的物質(zhì)能顯著加快慢性創(chuàng)面的愈合，提示具有抑菌活性和抗炎作用的雙效化合物能促進慢性創(chuàng)面的愈合，因此研發(fā)兼具有抑菌活性和抗炎作用

2、的雙效化合物可能是治療此類感染的有效策略。以小檗堿為主要成分的黃連素是臨床上著名的抗菌藥物，體外抗菌活性研究表明從木豆葉中提取的木豆素具有良好的抑菌活性。同時，有研究表明小檗堿和木豆素除具有抑菌作用之外還具有抗炎活性，具備作為兼具抑菌和抗炎雙效化合物的特性。本課題組在前期的工作中以小檗堿為前體，合成了 C-9-O位修飾的小檗堿新型衍生物；以木豆素為前體，合成了對其C-1位羧基、C-3位異戊烯基和芳香B環(huán)進行改造的新型木豆素衍生物，并已通

3、過抗菌研究發(fā)現(xiàn)了部分合成衍生物具有良好的抑菌作用。本論文的主要研究目的是對這些合成的新型小檗堿衍生物和新型木豆素衍生物的體內(nèi)外抗炎活性進行評價，并對活性較好的化合物的抗炎作用機制進行研究，為研究和開發(fā)新型兼具抑菌和抗炎雙效藥物提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一章小檗堿合成衍生物的抗炎作用研究
　　方法：
　　1.體外抗炎活性研究
　　以內(nèi)毒素（LPS）刺激小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為炎癥細胞模型，檢測小檗堿合成衍生物

4、對炎癥細胞一氧化氮（NO）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）釋放的影響。采用Griess法測定細胞上清液中NO含量。采用酶聯(lián)免疫（Elisa）法測定細胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。
　　2.體內(nèi)抗炎活性研究
　　以熒光標記中性粒細胞和巨噬細胞的轉(zhuǎn)基因胚胎斑馬魚（Coroninla-eGFP/Lyc-dsRed）為實驗動物，采用斷尾手術(shù)建立斑馬魚炎癥模型。在熒光顯微鏡下活體觀察斑馬魚體內(nèi)熒光標記的

5、免疫細胞在小檗堿合成衍生物作用下的遷移動態(tài)，考察小檗堿合成衍生物的體內(nèi)抗炎效果。
　　3.抗炎機制研究
　　采用蛋白印跡（Western-blot）法分析小檗堿合成衍生物對 RAW264.7炎癥細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路中κB抑制蛋白-α（IκBα）、p65蛋白的磷酸化水平和誘生型一氧化氮合成酶（iNOS）蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.體外抗炎活性研究
　　NO的檢測結(jié)果表明，小檗堿合

6、成衍生物B-3i和B-5e在2.5μM和5μM的濃度下，均顯著抑制了炎性RAW264.7細胞中NO的釋放，且其抑制活性優(yōu)于小檗堿和陽性對照藥物吲哚美辛。對炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的檢測結(jié)果表明，5μM濃度的B-3i和B-5e處理顯著減少了 TNF-α、IL-6的釋放，且均比吲哚美辛處理的細胞的釋放量明顯減少，其中TNF-α的釋放量低于小檗堿處理的細胞。提示B-3i和B-5e是優(yōu)于小檗堿和吲哚美辛的具有較好抗炎活性的化合物。

7、>　　2.體內(nèi)抗炎活性研究
　　結(jié)果表明，與斑馬魚炎癥模型相比，小檗堿合成衍生物B-3i和B-5e處理明顯抑制了斷尾手術(shù)后3h、6h、9h時間點時斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞和巨噬細胞向傷口遷移。提示小檗堿合成衍生物B-3i和B-5e有抑制中性粒細胞和巨噬細胞遷移的體內(nèi)抗炎活性。
　　3.抗炎機制研究
　　結(jié)果表明，小檗堿合成衍生物B-3i和B-5e處理明顯抑制了炎性RAW264.7細胞NF-κB信號通路蛋白IκBα、p65的

8、磷酸化，提示其抑制了NF-κB信號通路的活化；小檗堿合成衍生物B-3i和B-5e處理也明顯抑制了炎性RAW264.7細胞iNOS蛋白的表達，提示小檗堿合成衍生物抑制NO的釋放是通過NF-?B信號通路介導(dǎo)的iNOS蛋白的表達受到抑制的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　小檗堿合成衍生物B-3i和B-5e是優(yōu)于小檗堿的具有較好體內(nèi)外抗炎活性的化合物，其抗炎作用機制與抑制 NF-κB信號通路的活化有關(guān)，該類化合物可為小檗堿類兼具抑菌和抗炎雙效

9、藥物的研究提供可能的科學(xué)依據(jù)。
　　第二章木豆素及其合成衍生物的抗炎活性及抗炎機制研究
　　方法：
　　1.細胞毒性研究
　　以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為實驗細胞，用MTT法檢測木豆素及合成的各系列新型衍生物對細胞生長的影響。
　　2.體外抗炎活性研究
　　以LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為炎癥細胞模型，檢測了木豆素及其合成衍生物處理對炎癥細胞NO和炎癥細胞因子TNF-α、IL-6

10、釋放的影響。采用Griess法測定細胞上清液中NO的含量。采用Elisa法測定細胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。
　　3.體內(nèi)抗炎活性研究
　　以熒光標記中性粒細胞和巨噬細胞的轉(zhuǎn)基因胚胎斑馬魚（Coroninla-eGFP/Lyc-dsRed）為實驗動物，采用斷尾手術(shù)造成斑馬魚炎癥模型。在熒光顯微鏡下活體觀察斑馬魚體內(nèi)熒光標記的中性粒細胞和巨噬細胞在木豆素及其合成衍生物作用下的遷移動態(tài)，考察木豆素及其合成衍生物的體內(nèi)抗

11、炎效果。
　　4.抗炎機制研究
　　采用 Western-blot法分析木豆素及其合成衍生物對 LPS刺激 RAW264.7炎癥細胞NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的影響。以LPS刺激佛波酯（PMA）誘導(dǎo)的U937巨噬細胞為炎癥細胞，采用Western-blot法分析木豆素及其衍生物對在LPS刺激下的U937巨噬細胞過氧化物增殖物受體γ（PPARγ）蛋白表達的影響。以LPS刺激的RAW264.7細胞為炎癥細

12、胞，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法分析木豆素及其合成衍生物對在LPS刺激下的細胞PPARγ信使核糖核酸（mRNA）表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.細胞毒性研究
　　結(jié)果表明，和木豆素相比，C-1位羧基甲酯化的3a-3k和4a-4k系列木豆素合成衍生物明顯降低了細胞毒性，而保留C-1位羧基，在B環(huán)引入吸電子基團和給電子基團的5a-5k系列木豆素合成衍生物的細胞毒性有所提高，推測C-1位羧基對細胞的活力影響較大

13、。
　　2.體外抗炎活性研究
　　對NO的檢測結(jié)果表明，和木豆素相比，3a-3k和4a-4k系列合成衍生物對NO釋放的抑制作用有所下降，5a-5k系列衍生物的抑制活性增加較多，其中衍生物5c、5e和5h表現(xiàn)了很好的抑制NO釋放的作用。對炎癥因子TNF-α、IL-6的檢測結(jié)果表明，木豆素及其合成衍生物5c、5e和5h處理顯著抑制了炎性RAW264.7細胞炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的釋放。以上說明，木豆素及其合成衍生物5c

14、、5e和5h具有較好的體外抗炎活性。
　　3.體內(nèi)抗炎活性研究
　　結(jié)果表明，與斑馬魚炎癥模型相比，木豆素及其合成衍生物5c處理明顯抑制了斷尾手術(shù)后3h和6h時間點時斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞和巨噬細胞向傷口遷移。提示木豆素及其合成衍生物5c有抑制中性粒細胞和巨噬細胞遷移的體內(nèi)抗炎活性。
　　4.抗炎機制研究
　　結(jié)果表明，木豆素及其合成衍生物5c處理明顯抑制了炎性RAW264.7細胞NF-κB信號通路蛋白IκBα、p

15、65和MAPK通路胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）和p38的磷酸化，PPARγ抑制劑GW9662部分抵抗了該作用。木豆素及其衍生物5c處理減少了在LPS刺激下的巨噬細胞PPARγ蛋白和mRNA表達水平的下降，提示其抗炎作用機制是通過增加PPARγ的表達及抑制NF-κB和MAPK信號通路的活化有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　綜合細胞毒性和抗炎活性分析，毒性小的3a-3k和4a-4k系列合成衍生物的抗炎活性不及毒

16、性有所增加的5a-5k系列衍生物。從結(jié)構(gòu)上看，3a-3k和4a-4k系列與5a-5k系列最大的不同在 C-1位羧基是否酯化，甲酯化的3a-3k和4a-4k系列抗炎活性下降；保留C-1位羧基不變，改造B環(huán)的5a-5k系列合成衍生物的抗炎活性較好。推測C-1位羧基是木豆素產(chǎn)生抗炎活性的關(guān)鍵基團。
　　木豆素及其合成衍生物5c、5e和5h具有較好的體內(nèi)外抗炎活性，其抗炎作用機制是通過增加PPARγ的表達、抑制NF-κB和MAPK信號通路