新型娃兒藤堿衍生物NK-007在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎和腸炎模型中作用機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factorα)作為一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)的糖蛋白于1975年被發(fā)現(xiàn),當(dāng)腫瘤壞死因子alpha被移植到小鼠體內(nèi),人們發(fā)現(xiàn)它能引發(fā)腫瘤的敗血壞死。人的腫瘤壞死因子于1985年被克隆出來,而且重組的TNF-α能夠使小鼠的腫瘤敗血壞死,由于此,TNF-α與很大范圍的炎癥、感染以及惡劣條件相關(guān),并且通過有效運用抗TNF-α的抗體或者注射可溶性的TNF-α受體(TNFRs)能達到控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥活性以

2、及其他炎癥疾病的目的,TNF-α在炎癥中的重要性也逐漸被人們賦予高度重視。
  在我們已發(fā)表的文章中,我們發(fā)現(xiàn)新娃兒藤堿DCB-3503能夠抑制小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)病,其中的機制是通過影響固有細胞產(chǎn)生TNF-α的能力。但是由于DCB-3503多方面的性能,如復(fù)雜的合成工藝和不溶于水等特性,我們合成了許多DCB-3503的衍生物,并通過一套穩(wěn)定的抗TNF-α篩選體系,篩選出NK-007在抗TNF方面有突出效果,并且NK-007在多方面的性

3、能優(yōu)于DCB3503,比如,水溶性、和簡易合成過程。除此之外,由于關(guān)節(jié)炎與腸炎都是典型的TNF-α誘導(dǎo)的炎癥疾病,前期的工作也在兩種動物模型(膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和腸炎模型)中驗證了NK-007抗TNF-α的體內(nèi)作用,從而減緩并抑制了小鼠關(guān)節(jié)炎或腸炎的發(fā)病進程,我的工作主要是參與了NK-007抗炎作用機制的探究。
  隨后我們發(fā)現(xiàn),NK-007之所以可以抑制或減緩小鼠在關(guān)節(jié)炎模型中的發(fā)病,一方面是因為抑制了關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠關(guān)節(jié)局部和全身

4、引流淋巴結(jié)產(chǎn)生TNF-α的功能。同時,熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)NK-007不具有下調(diào)TNF轉(zhuǎn)錄的功能,而向細胞培養(yǎng)液中添加放線菌素D的方法驗證了NK-007具有下調(diào)TNF-α轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性的作用,這些結(jié)果說明NK-007在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TNF-α的表達。基于以上兩種現(xiàn)象,我們采用蛋白印跡檢測法去探究在TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性信號通路中NK-007發(fā)揮的作用,結(jié)果顯示磷酸化的p-38蛋白以及MK2在NK-007處理過的細胞中顯著低表達,TPP作為

5、TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的負調(diào)控因子在NK-007處理過的細胞中表達明顯升高。
  另一方面是因為NK-007具有降低關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠引流淋巴結(jié)中Th17細胞亞群的比率。為了進一步研究Th17細胞在關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠體內(nèi)減少的機制,我們對樹突狀細胞進行NK-007預(yù)處理,結(jié)果顯示經(jīng)過NK-007處理過的樹突狀細胞中的IL-6表達明顯降低。通過這一現(xiàn)象,我們就假設(shè)NK-007通過抑制樹突狀細胞產(chǎn)生IL-6的能力,進而間接地抑制了Th17細胞

6、的分化。為了驗證這一假設(shè),我們在缺乏IL-6的誘導(dǎo)Th17分化的體系中加入NK-007處理過的樹突狀細胞的上清液,然后使之與對照組相比,發(fā)現(xiàn)NK-007確實抑制Th17的分化.隨后,我們又進一步探討了NK-007是否可以直接抑制Th17細胞的分化,我們在缺少IL-6的誘導(dǎo)Th17細胞分化的體系中對其分別進行NK-007或空白試劑處理,并用流式細胞儀檢測法檢測不同處理組的Th17細胞分化情況,我們得到的結(jié)果顯示NK-007處理組誘導(dǎo)Th1

7、7細胞分化的比例顯著降低,表明NK-007具有直接抑制Th17分化的功能。
  NK-007之所以能抑制或減緩小鼠在腸炎模型中的發(fā)病,是因為NK-007具有通過下調(diào)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和骨髓來源的樹突狀細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12的作用。由于NF-κB(p50/p65)是調(diào)控天然免疫和適應(yīng)性免疫中相關(guān)基因表達的主要轉(zhuǎn)錄因子,所以我們就采取western blot的方法對p65,p-p65,IκB和p-IκB的表達進行了研究,結(jié)

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