斷藤益母湯及其組方藥物對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠骨代謝的影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　通過本研究，希望能夠明確斷藤益母湯對RA骨代謝影響的確切作用，重點探討RANKL/OPG信號通路和Wnt/β-catenin信號通路在RA骨代謝中的作用機制和斷藤益母湯的作用機理，為其臨床應用提供理論依據。
　　方法：
　　1.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠的治療作用
　　實驗分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明

2、山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應用經典的RA模型——膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)大鼠模型，各干預組在CIA大鼠模型加強免疫7天后即在造模第14天開始給予相應的處理。根據臨床計量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純

3、凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標:大鼠一般情況觀察，如體毛、活動、飲食、排泄等，體重變化，關節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)評分，大鼠左、右后足爪容積;HE染色法觀察大鼠左側踝關節(jié)滑膜、軟骨的病理學改變情況;ELISA法測量大鼠血清TNF-α濃度。
　　數(shù)據分析:數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，采用重復測量資料的

4、方差分析和one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠骨密度、骨小梁分析的影響
　　實驗分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲

5、氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為4只。
　　處理方法:應用CIA大鼠模型，各干預組在加強免疫7天后即在造模第14天開始給予相應的處理。根據臨床計量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標:Micro-CT影像學評

6、價;骨骼礦物質參數(shù)指標:骨礦物質含量(bonemineral content，BMC)、骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）;體視學測量參數(shù)指標:骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecularnumber，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，骨表面積/體積(bone surfacearea/bone vo

7、lume，BS/BV)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp);結構模型指數(shù)參數(shù)指標:骨小梁模式因子(trabecular pattern factor，Tb.Pf)、結構模型指數(shù)(structure model index, SMI)。
　　數(shù)據分析:數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD

8、檢驗，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠破骨細胞、成骨細胞的影響
　　實驗分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應用CIA大

9、鼠模型，各干預組在加強免疫7天后即在造模第14天開始給予相應的處理。根據臨床計量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標:抗酒石酸酸性磷酸酶及堿性磷酸酶(TRACP&ALP)雙重染色法觀測大鼠踝關節(jié)破骨細胞(osteoclast

10、，OC)和成骨細胞(osteoblast，OB)的數(shù)量;ELISA法檢測大鼠血清OC標志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和OB標志物骨堿性磷酸酶(BALP)的濃度。
　　數(shù)據分析:數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.斷藤

11、益母湯及其組方藥物對PANKL/OPG信號通路的調節(jié)作用
　　實驗分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應用CIA大鼠模型，各干預組在加強免疫7天后即在造模第14天開始給予相應的處理。根據臨床計量換算，KDM、

12、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標:免疫組化法(IHC)觀測大鼠踝關節(jié)RANKL、OPG的蛋白表達量;ELISA法檢測大鼠血清RANKL、OPG的濃度。
　　數(shù)據分析:數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差((x)±

13、s)表示，采用one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.斷藤益母湯及其組方藥物對Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)作用
　　實驗分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為

14、空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為4只。
　　處理方法:應用CIA大鼠模型，各干預組在加強免疫7天后即在造模第14天開始給予相應的處理。根據臨床計量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標:QPCR法

15、檢測大鼠踝關節(jié)Wnt3a、β-catenin、Dickkopf-1的mRNA的表達。
　　數(shù)據分析:數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　斷藤益母湯、昆斷湯、昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤均能不同程度改善CIA大鼠的骨侵

16、蝕情況，其中斷藤益母湯組在抑制炎癥指標和促進骨保護方面均優(yōu)于昆斷湯、昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組;昆斷湯在促進骨保護方面優(yōu)于昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組;昆母湯在抑制炎癥指標方面優(yōu)于昆斷湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組。
　　斷藤益母湯能降低CIA大鼠踝關節(jié)中RANKL的表達、升高OPG的表達，抑制RANKL/OPG信號通路對破骨細胞的分化、成熟，抑制骨吸收;同時能升高CIA大鼠踝關節(jié)中Wnt3a、β-catenin的mRNA表達、