HKa輕鏈D5區(qū)及其合成肽對MDA-MB-231細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的： 高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HK)是凝血系統(tǒng)接觸因子之一，在許多病理生理學過程中發(fā)揮重要作用，如纖維蛋白溶解作用、血栓形成和炎癥等。HK由重鏈、含緩激肽(bradykinin，BK)肽段和輕鏈三部分組成。重鏈包括D1～D3區(qū)，BK組成部分居于D4區(qū)，輕鏈包括D5和D6區(qū)。HK被激肽釋放酶活化釋放緩激肽形成雙鏈高分子激肽原(cleaved high moleeular w

2、eight kininogen，HKa)，HK轉(zhuǎn)變?yōu)镠Ka發(fā)生了較大的構(gòu)像變化使D5區(qū)暴露更加明顯，HKa由于各區(qū)域的重新排列獲得了新的功能，具有較強的抗粘附效應(yīng)。研究已發(fā)現(xiàn)HKa輕鏈富含組氨酸區(qū)域(histidine-rich domain，HRD)，即D5區(qū)是HKa抗細胞伸展的活性區(qū)域，也是HKa抑制血管生成的活性區(qū)域，因此被Colman等稱作激肽抑制素。 最初Colman等提出HKa和D5區(qū)可以抑制血管生成，并進一步證實了

3、HKa能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增生并誘導(dǎo)其凋亡，提示這是它們抑制血管生成的關(guān)鍵步驟。此外，Katkade等發(fā)現(xiàn)HKa和D5區(qū)通過裂解與尿激酶型纖溶酶原活化物受體(uPAR)結(jié)合啟動的信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。腫瘤細胞經(jīng)常過度表達uPAR，而目前的研究中所采用的腫瘤細胞系較少，HKa對不同腫瘤的作用是否存在異質(zhì)性，以及負責其發(fā)揮抑制活性的核心氨基酸序列還需深入研究。本實驗旨在進一步明確HKa輕鏈D5區(qū)抑制腫瘤細胞的分子機制，渴

4、望發(fā)現(xiàn)D5區(qū)發(fā)揮活性作用的最小功能區(qū)。 實驗材料： 1、MDA-MB-231細胞株2、HK D5區(qū)重組蛋白及其合成肽3、WST法檢測細胞增殖活性的相關(guān)試劑4、Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡的相關(guān)試劑實驗方法1、多肽合成依據(jù)HKa的402～502殘基序列合成P-5(479-493)、P-5n(480-487)、P-5m(484-491)和P-5c(488-495)共4種選擇肽，通過高效液相色譜法純化

5、，純度為90％以上。 2、HK r-HRD的制備擴增編碼氨基酸從His411到Trp 501的HK cDNA，PCR引物：上游引物5‘-CCGGCATATGTCTAGACCCAACCATTGTGTGCTTTCC-3’，下游引物 5’-CCGGCATATGCATGACTGGGGCCATG-3’。為便于克隆，在上游引物5′端引入Nde Ⅰ酶切位點，下游引物引入一個Xba Ⅰ酶切位點。 3、細胞培養(yǎng) MDA-MB-23

6、1細胞培養(yǎng)采用含8％小牛血清，100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：37℃，濕度100％，CO<,2>濃度為5％。 4、細胞增殖分析用WST法檢測r-HRD及HKa D5區(qū)合成肽對MDA-MB-231細胞增生的影響。接種對數(shù)生長期細胞于96孔板，加入2umol/L r-HRD及不同濃度的HKa D5區(qū)合成肽，培養(yǎng)22h后，加入10ul WST-8溶液后繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標儀測定450nm

7、吸光度，完全培養(yǎng)基作為空白對照，每個濃度重復(fù)6個孔。 5、細胞形態(tài)的觀察于倒置相差顯微鏡下觀察各實驗組及對照組MDA-MB-231細胞形態(tài)及貼壁情況。 6、流式細胞儀檢測細胞凋亡分別收集2umol/L r-HRD及200、400、800umol/L HKa D5區(qū)合成肽處理24h的細胞，Annexin/PI雙染色，流式細胞儀檢測，每份標本檢測10 000個細胞，計算凋亡百分率，記錄、存儲和分析結(jié)果。 結(jié)論：