HS對(duì)MDA-MB-231內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝素酶表達(dá)及凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　1、研究誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激對(duì)乳腺癌MDA-MB-231肝素酶(Heparanase，HPSE)表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響。
　　2、探討硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）對(duì)處于 ER應(yīng)激乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein, GRP78)、HPSE表達(dá)及凋亡的影響。
　　3、研究S

2、iRNA敲減GRP78對(duì)HS治療乳腺癌細(xì)胞凋亡敏感性的影響。
　　方法：
　　1、提取MCF-7細(xì)胞匯合期培養(yǎng)液中的HS鏈；以濃度300、600、900、1200μg/mL的HS處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24、36、72h后采用MTT比色法，檢測(cè)增殖抑制率。
　　2、以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對(duì)象，用不同處理因素（無(wú)血清、低糖、低氧、化療藥物）不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）處理細(xì)胞，West

3、ern blotting檢測(cè)GRP78和HPSE的表達(dá)；同上處理,溴化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　3、分別用HS、衣霉素（Tunicamycin, TM）和HS+TM不同時(shí)間（0、6、12、24、36和48h）處理細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)GRP78和HPSE的表達(dá)；同上處理細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　4、分別用HS、TM和HS+

4、TM處理細(xì)胞48h，用RT-PCR法檢測(cè)GRP78mRNA和HPSEmRNA的表達(dá)。
　　5、SiRNA轉(zhuǎn)染敲減GRP78的表達(dá)，檢測(cè)HS誘導(dǎo)凋亡率的改變。
　　結(jié)果：
　　一、HS對(duì)乳腺癌MDA-MA-231細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　MTT法顯示結(jié)果為不同濃度的HS均能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組比較有顯著差異（P﹤0.05），且隨著HS濃度的增加抑制率隨之增大，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率也隨之增加；大劑量組H

5、S1200μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，作用72h后，最大抑制率為65.59％。
　　二、誘導(dǎo)ER應(yīng)激對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞HPSE表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響
　　1、無(wú)血清、低糖、低氧、順鉑均可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)GRP78和HPSE的表達(dá)（P<0.01）；同時(shí)PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，顯示四種處理因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡均不敏感。
　　2、給予經(jīng)典的ER stress誘導(dǎo)劑TM同

6、樣可以上調(diào)GRP78和HPSE蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.01)。PI染色后流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析， MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率在48h時(shí)達(dá)最高為22.62%,與對(duì)照組0h相比,36h、48h差異具有顯著性（P<0.01)。
　　三、HS對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞GRP78、HPSE表達(dá)及凋亡的影響
　　1、HS可以下調(diào)GRP78和HPSE蛋白表達(dá)，尤其在36和48h時(shí)下調(diào)的最為顯著（P<0

7、.01)。PI染色后流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析， MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率在48h時(shí)達(dá)最高約30%,與對(duì)照組0h相比,36h、48h差異具有顯著性（P<0.01)。
　　2、HS可降低TM誘導(dǎo)的GRP78和HPSE蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，不同作用時(shí)間組GRP78和HPSE表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P<0.01)。
　　3、HS增加TM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率，與對(duì)照組比較，有顯著差異（P<0.01)。
　　4、HS能將GRP78

8、 SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率提升到70%以上，與對(duì)照組比較，有顯著差異（P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、HS對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有抑制作用，且這一作用呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。
　　2、當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，HPSE的表達(dá)像GRP78一樣發(fā)生上調(diào)。HPSE表達(dá)的上調(diào)提示HPSE可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制的構(gòu)建，它可能構(gòu)成腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受的原因之一。
　　3、HS對(duì)