缺氧海馬神經(jīng)元中p53對其下游基因的調(diào)控.pdf

1、細(xì)胞在應(yīng)對外界激刺激時(shí)，通過活化自身的信號(hào)通路，激活相關(guān)因子，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而適應(yīng)外界條件的轉(zhuǎn)變，而p53是細(xì)胞在面對遺傳毒性、非遺傳毒性刺激時(shí)，細(xì)胞所激活的關(guān)鍵分子，其活化可激活不同類型靶基因，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯、凋亡、壞死等變化，同時(shí)參與DNA損傷修復(fù)。細(xì)胞內(nèi)對p53的調(diào)控主要是通過轉(zhuǎn)錄后修飾，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷，缺氧和高溫等刺激時(shí)，MDM2催化的泛素蛋白酶體依賴的降解通路受到抑制，從而導(dǎo)致p53降解以及其從核內(nèi)的轉(zhuǎn)出減少

2、，核內(nèi)p53聚集，進(jìn)而誘導(dǎo)或抑制其下游調(diào)控細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡的靶基因轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生對應(yīng)于相應(yīng)生理應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)。目前的研究顯示p53的活化受細(xì)胞種類，刺激形式和細(xì)胞周圍環(huán)境等多方面因素的影響，即對應(yīng)不同的刺激信號(hào)p53激活不同組合的下游靶基因。缺氧是一種重要的生理刺激，在正常發(fā)育和腫瘤形成以及轉(zhuǎn)移中都擔(dān)任著重要的角色。嚴(yán)重缺氧時(shí)可以引起胞內(nèi)p53的積累，從而引起細(xì)胞凋亡。與其他引起DNA斷裂的胞外刺激不同，缺氧活化的p53幾乎沒有轉(zhuǎn)

3、錄激活功能，而是以轉(zhuǎn)錄抑制功能為主。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的海馬CAl神經(jīng)元對缺氧最為敏感，同時(shí)不同發(fā)育時(shí)期，大腦對缺氧的耐受能力有所差異，因此本實(shí)驗(yàn)選取海馬神經(jīng)元為研究對象，對不同發(fā)育階段p53在缺氧時(shí)的作用以及缺氧時(shí)p53對其下游基因的調(diào)控方式進(jìn)行初步探討，以期為大腦缺血缺氧損傷的進(jìn)一步的研究提供一些線索。 目的： 研究不同發(fā)育時(shí)期，大鼠海馬神經(jīng)元缺氧耐受性差異的分子機(jī)制，以及缺氧時(shí)大鼠海馬神經(jīng)元中的p53對其下游基因的轉(zhuǎn)錄

4、調(diào)控模式，以期為大腦缺血缺氧損傷的進(jìn)一步研究提供線索。 方法：將取材于出生后1d和5d的大鼠海馬神經(jīng)元分為常氧組，缺氧組和給藥組。神經(jīng)元培養(yǎng)7天后，進(jìn)行缺氧處理(O％O<,2>，5％CO<,2>,和95％N<,2>)12h或24h。藥物則在缺氧處理前2h加入培養(yǎng)基中。采用倒置顯微鏡和NF免疫組織化學(xué)法觀察細(xì)胞生長和形態(tài)，比較不同發(fā)育階段大鼠海馬神經(jīng)元耐受缺氧的能力；Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，RT-PCR檢測相關(guān)基因mR

5、NA水平的表達(dá)，以了解缺氧應(yīng)激下ATP依賴的鉀離子通道(K<,ATP>)與p53信號(hào)通路之間的關(guān)系。免疫熒光檢測膜蛋白UNC5B在各組的表達(dá)變化，探討缺氧應(yīng)激下p53對UNC5B的調(diào)控方式；MTT比色法和AO/EB雙染法檢測細(xì)胞存活率，分析不同處理組之間細(xì)胞存活率的差異。 結(jié)果： 1．①充氧組中出生后5d大鼠海馬神經(jīng)元生長狀態(tài)要優(yōu)于對照組中培養(yǎng)的神經(jīng)元。②出生后1d以及5d大鼠海馬神經(jīng)元缺氧12h時(shí)細(xì)胞凋亡率分別為81.

6、04±2.25％(n=6)和89.4±2.197％(n=7)(p<0.01)；缺氧24h時(shí)二者凋亡率分別為74.99±2.751％(n=7)和85.02±2.242％(n=7)p<0.01)。③5d海馬神經(jīng)元缺氧耐受能力優(yōu)于1d大鼠海馬神經(jīng)元。 2．①給予細(xì)胞K<,ATP>通道的激活劑和阻斷劑后，通過RT-PCR檢測海馬神經(jīng)元中p53下游靶基因mRNA表達(dá)水平變化，以了解K<,ATP>通道與p53信號(hào)通路的關(guān)系。缺氧+二氮嗪組中

7、Bax的mRNA表達(dá)水平與單純?nèi)毖踅M相比明顯下降(n=5)(p<0.01)，在缺氧+甲苯磺丁脲組中Bax的mRNA表達(dá)水平相對與單純?nèi)毖踅M也有提高(n=5)(p<0.05)；Fas的mRNA表達(dá)水平缺氧+二氮嗪組(n=5)(p<0.01)和缺氧+甲苯磺丁脲組(n=5)(p<0.05)與單純?nèi)毖踅M比都有差異；缺氧組中α-tubulin的mRNA表達(dá)水平與常氧時(shí)比明顯下降(n=5)(p<0.01)，缺氧+二氮嗪組和缺氧+甲苯磺丁脲組中其mR

8、NA表達(dá)水平與單純?nèi)毖踅M相比沒有明顯差異。②MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。單純?nèi)毖踅M，缺氧+二氮嗪組和缺氧+甲苯磺丁脲組的細(xì)胞存活率分別是75.7±2.8％(n=7)，55.7±2.5％(n=6)和81.1±2.4％(n=6)，各加藥組與單純?nèi)毖踅M比較具有顯著性差異(p<0.01)。常氧時(shí)，加藥組與對照組細(xì)胞(n=6)存活率無顯著性差異(p>0.05)。③采用NF免疫組織化學(xué)法觀察細(xì)胞生長和形態(tài)。單純?nèi)毖踅M，缺氧+二氮嗪組和缺氧+甲苯磺丁

9、脲組的多極神經(jīng)元的百分率分別是20.6+2.0％(n=6)，26.1±1.7％(n=6)和8.7±1.7％(n=6)，各加藥組與單純?nèi)毖踅M比較都具有顯著性差異(p<0.01)，常氧時(shí)，加藥組與對照組細(xì)胞(n=6)存活率無顯著性差異(p>0.05)。 3．①為了研究p53對UNC5B的調(diào)控方式，我們采用RT-PCR分別檢測了UNC5B在常氧和缺氧時(shí)加入p53抑制劑PFT-α(100nM<'[5]>)和p53激活劑nutlin-3(

10、2μM)時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與常氧比較缺氧時(shí)UNC5B轉(zhuǎn)錄水平下降，(p<0.01，n=5)。常氧時(shí)nutlin-3(p<0.01,n=5)激活UNC5B的轉(zhuǎn)錄，而PFT-α對其無顯著影響。缺氧時(shí)nutlin-3(p<0.01,n=5)抑制UNC5B的轉(zhuǎn)錄，而PFT-α(p<0.01，n=5)則激活UNC5B的轉(zhuǎn)錄。②采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。缺氧時(shí)細(xì)胞存活率(75.0±2.8％)要明顯低于常氧時(shí)(p<0.01，n=7)。常氧

11、時(shí)PFT-α和nutlin-3都不影響細(xì)胞的存活(p>0.05,n=5)。而缺氧時(shí)卻不同，PFT-α可以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡(85.2±5.6％)，存活率與單純?nèi)毖踅M相比有顯著性差異(p<0.01，n=6)。nutlin-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡(57.1±4.1％)，存活率與單純?nèi)毖踅M比有顯著性差異(p<0.01，n=7)。③免疫熒光檢測各處理組海馬神經(jīng)元上UNC5B的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與常氧(129.959±21.633，n=122)比較缺氧

12、(104.078±19.058，n=98)時(shí)UNC5B蛋白表達(dá)水平下降(p=0.000<0.01)。常氧時(shí)nutlin-3(150.014±26.303，n=123)促進(jìn)UNC5B的蛋白表達(dá)(p=0.000<0.01)，而PFT-α(124.072±28.016，n=106)對其無顯著影響(p=0.709>0.05)。缺氧時(shí)nutlin-3(95.244±12.354，n=108)與單純?nèi)毖踅M相比顯著抑制UNC5B蛋白表達(dá)(p=0.00

13、2<0.01)，而PFT-α(104.541±19.080，n=104)同單純?nèi)毖踅M比無顯著性變化(p=1.000)。 結(jié)論： 1．5d大鼠海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)過程中充氧有利于神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，出生后5d大鼠海馬神經(jīng)元缺氧耐受力強(qiáng)于出生后1d大鼠海馬神經(jīng)元。 2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：缺氧時(shí)K<,ATP>通道的開放可保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷，并且K<,ATP>主要通過影響p53轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元的缺氧保護(hù)功能