p53及其下游靶基因MTA1、HIF-1α在上皮性卵巢癌表達(dá)的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居首位。因其發(fā)病隱避，診斷比較困難，初期無明顯臨床癥狀，超過70％的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)
　　已為晚期，5年生存率約40％，且腫瘤極易產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移，療效差，嚴(yán)重影響卵巢癌患者的預(yù)后。近年來，雖然上皮性卵巢癌的傳統(tǒng)療法包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的手術(shù)治療、并輔以化學(xué)藥物治療和放射治療在醫(yī)療器械和技術(shù)水平上有很大的改善，但卵巢癌晚期患者5年生存率仍無明顯提高，約30%左右

2、。其中主要原因是約35%卵巢癌患者對化療藥物耐藥；不僅如此，約60％對一線化療藥物敏感的卵巢癌患者在治療半年以后便產(chǎn)生耐藥，這樣使得卵巢癌患者更加容易復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響預(yù)后。因此，卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅了患者的生命健康，也是治療過程中最大的難題，如何有效的控制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，提高生存率成為研究熱點(diǎn)。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis-associated protein1，MTA1）基因是在鼠乳腺癌細(xì)胞

3、株中分離出新的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的編碼基因，它是通過調(diào)控一系列與浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白，在癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)
　　MTA1在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌、胃腸道癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，還參與了腫瘤其他多種惡性能力的調(diào)控，如血管生成、耐放化療等等，最終導(dǎo)致腫瘤的高復(fù)發(fā)和不良預(yù)后。MTAl蛋白可與其他蛋白發(fā)生作用，在信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮一定作用，對MTA1基因功能及作用機(jī)制的深入研究，可為腫瘤轉(zhuǎn)移的

4、控制以及靶基因藥物研制提供一定的指導(dǎo)意義。有研究證實(shí)MTA1基因是 p53的一個(gè)靶基因，Lee[1]等的研究發(fā)現(xiàn)乙酰化的p53蛋白通過靶向結(jié)合在MTA1啟動(dòng)子區(qū)域?qū)е翸TA1基因的轉(zhuǎn)錄抑制，5-FU正是通過誘導(dǎo)p53蛋白的乙酰化從而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MTA1可以通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）蛋白的去乙?；{(diào)控腫瘤的血管生成及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[2]

5、。近年來，隨著分子遺傳學(xué)的研究的不斷發(fā)展，其與分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在卵巢癌的分子水平致癌機(jī)制的研究越來越來深入。那么在卵巢中調(diào)控MTA1轉(zhuǎn)錄抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。從生物學(xué)角度看，各指標(biāo)之間可能存在著極其復(fù)雜的關(guān)系，對其中一種指標(biāo)的單獨(dú)檢測是不全面的。越來越多生物基礎(chǔ)研究中提示著MTA1與p53、HIF-1α的關(guān)系密切，而在關(guān)于卵巢癌研究中三個(gè)基因之間的相關(guān)性卻無文獻(xiàn)支持。因此，為研究其在卵巢癌中的作用機(jī)制

6、，分別設(shè)置MTA1上下游基因p53和HIF-1α，來討論MTA1在卵巢惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制，可提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　1.通過檢測卵巢惡性組織、卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織中MTA1、p53和HIF-1α蛋白表達(dá),分別探討這三種基因蛋白在不同卵巢組織中表達(dá)水平，并分析其相關(guān)性；
　　2.通過轉(zhuǎn)染野生型p53基因，檢測卵巢癌細(xì)胞中MTA1及其下游靶基因HIF-1α的表達(dá)水平，探討卵巢癌轉(zhuǎn)移

7、相關(guān)的可能作用機(jī)制，擬為卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的作用機(jī)制提供可能的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.在組織水平，采用免疫組織化學(xué)方法（S-P法）分別檢測正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤及卵巢癌組織中MTA1，p53，HIF-1α蛋白的表達(dá)水平；
　　2.在細(xì)胞水平，檢測四株人卵巢癌細(xì)胞株 A2780、HO-8910、OVCAR-3及SKOV-3中MTA1 mRNA表達(dá)水平，篩選出MTA1高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞系；
　

8、　3.構(gòu)建野生型p53基因慢病毒載體，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞系，提取細(xì)胞RNA，熒光定量PCR技術(shù)檢測p53、MTA1、HIF-1α的mRNA表達(dá)水平；探討p53與MTA1、HIF-1α在卵巢癌細(xì)胞中的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.正常卵巢組織MTA1的平均陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)水平為164.60±103.54個(gè)，卵巢良性腫瘤組織中MTA1平均陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)水平為194.70±100.40個(gè)，上皮性卵巢癌組織中MTA1平均陽性細(xì)胞數(shù)表

9、達(dá)水平為335.07±71.76個(gè)；上皮性卵巢癌組織中MTA1表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而正常卵巢組織與卵巢良性腫瘤組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　2.正常卵巢組織p53的平均陽性細(xì)胞數(shù)（呈正態(tài)分布）表達(dá)水平為7.27±4.832個(gè)，卵巢良性腫瘤組織中p53平均陽性細(xì)胞數(shù)（非正態(tài)分布）表達(dá)水平為13±10.25個(gè)，上皮性卵巢癌組織中p53平均陽性細(xì)胞數(shù)（非

10、正態(tài)分布）表達(dá)水平為177±318.25個(gè)；秩和檢驗(yàn)Mann-Whitney進(jìn)行三組間兩兩比較，結(jié)果顯示三組之間均有顯著性差異，水平高低為：正常組＜良性組＜惡性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；p53表達(dá)水平在上皮性卵巢癌組織中最高；
　　3.正常卵巢組織HIF-1α的平均陽性細(xì)胞數(shù)（非正態(tài)分布）表達(dá)水平為4±13個(gè)，卵巢良性腫瘤組織中HIF-1α平均陽性細(xì)胞數(shù)（非正態(tài)分布）表達(dá)水平為20.5±40.25個(gè)，上皮性卵巢癌組織

11、中HIF-1α平均陽性細(xì)胞數(shù)（呈正態(tài)分布）表達(dá)水平為357.97±229.38個(gè)；秩和檢驗(yàn)Mann-Whitney進(jìn)行三組間兩兩比較，結(jié)果顯示三組之間均有顯著性差異，水平高低為：正常組＜良性組＜惡性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；上皮性卵巢癌組織中HIF-1α表達(dá)水平最高；
　　4.相關(guān)性分析顯示：在65例卵巢組織標(biāo)本中MTA1和p53蛋白間的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)性（r=0.665，P<0.01），MTA1和HIF-1α蛋白

12、間的表達(dá)有顯著的正相關(guān)性（r=0.618，P<0.01），p53與HIF-1α蛋白間的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)性（r=0.722，P<0.05）；
　　5. MTA1蛋白在四株人卵巢癌細(xì)胞株中均有表達(dá),其中HO-8910細(xì)胞中水平最高，A2780其次；
　　6.野生型p53基因慢病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞系后，實(shí)驗(yàn)組的p53過表達(dá)效率分別是空白組和陰性對照組的3.35、3.25倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組

13、的MTA1 mRNA相對表達(dá)水平分別比空白組和陰性對照組降低了78%、71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組的HIF-1αmRNA相對表達(dá)水平分別比空白組和陰性對照組降低了39%、43%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　7.野生型p53基因慢病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞系后，實(shí)驗(yàn)組的p53過表達(dá)效率分別是空白組和陰性對照組的12.73、13.51倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組的MTA1相對表達(dá)水

14、平分別比空白組和陰性對照組降低了80.8%、79.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組的HIF-1α相對表達(dá)水平分別比空白組和陰性對照組降低了55.9%、54%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. MTA1、p53、HIF-1α基因在正常卵巢組織、良性腫瘤組織、卵巢惡性組織中均有表達(dá)，呈逐步遞增趨勢，且該三個(gè)基因之間的表達(dá)均呈正相關(guān)性，提示該三個(gè)基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系，為卵巢癌發(fā)生發(fā)