抗甲丸抗血管生成效應(yīng)觀察及對(duì)甲狀腺腫大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、甲狀腺腫，即良性的甲狀腺體積增大，是臨床常見病，在人口中的發(fā)病率達(dá)到10％以上，臨床上可分為毒性甲狀腺腫、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、單純性甲狀腺腫等類型。多種環(huán)境因素，如碘缺乏、碘過量、吸煙、感染、某些蔬菜等都會(huì)導(dǎo)致甲狀腺腫的發(fā)生。此外，多個(gè)研究證實(shí)遺傳因素在甲狀腺腫的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)甲狀腺腫的家系和孿生子研究，多個(gè)與甲狀腺腫有關(guān)的基因，如甲狀腺球蛋白、鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體等的異常相繼被發(fā)現(xiàn)。甲狀腺腫的發(fā)生還與

2、人體自身因素，如免疫、感染、性別等有關(guān)。甲狀腺腫的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的異常共同參與了甲狀腺腫的形成過程。 血管生成在甲狀腺腫的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。血管生成是指由原有血管出芽生長形成新生血管的過程。血管生成與腫瘤、肥胖、類風(fēng)濕、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞后和糖尿病等關(guān)系密切。多種活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)血管生成，其中VEGF、FGF和IGF-1起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)腫大的甲狀腺組織中，微血管密度明顯增加

3、，內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。VEGF和FGF在甲狀腺內(nèi)可以由濾泡細(xì)胞合成，能通過旁分泌作用刺激其受體，在甲狀腺腫時(shí)VEGF和FGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，可刺激甲狀腺內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管形成。IGF-1不但是非常重要的細(xì)胞生長因子，而且可以上調(diào)甲狀腺濾泡細(xì)胞VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，以便為增生的組織提供充足的營養(yǎng)和氧氣。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)TSH-TSHR信號(hào)通路激活后可以上調(diào)IGF-1和VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管生成，而TSH-TSHR通路則在

4、甲狀腺腫形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 從細(xì)胞生物學(xué)的角度，甲狀腺腫是甲狀腺細(xì)胞凋亡和增殖失衡，凋亡相對(duì)不足的結(jié)果。凋亡，即程序性細(xì)胞死亡，其過程受到細(xì)胞的精確調(diào)節(jié)。凋亡信號(hào)主要有內(nèi)外兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路。外源性信號(hào)通路主要由細(xì)胞表面的死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，傳導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。內(nèi)源性通路由線粒體介導(dǎo)，線粒體外膜穿孔導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，從而啟動(dòng)凋亡過程。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明甲狀腺腫存在凋亡信號(hào)和調(diào)節(jié)的異常。已證實(shí)在F

5、as存在于甲狀腺細(xì)胞膜上，F(xiàn)as的激活可以誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞的凋亡，在甲狀腺腫時(shí)甲狀腺細(xì)胞膜上的Fas表達(dá)減少。在大鼠甲狀腺腫模型上的研究表明Fas的數(shù)量與凋亡成正相關(guān)，在甲狀腺腫得到恢復(fù)時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)。Bcl－2是一種對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用的原癌基因，能夠抑制許多因素引起的細(xì)胞凋亡。Bcl-2在正常甲狀腺細(xì)胞表達(dá)，在毒性甲狀腺腫、藥物誘導(dǎo)的甲狀腺腫模型上表達(dá)顯著增加，伴隨著甲狀腺腫的消退，其表達(dá)量也減少。 甲狀腺腫的發(fā)生同時(shí)也是

6、甲狀腺細(xì)胞增殖過度的結(jié)果。TSH-TSHR信號(hào)通路是刺激甲狀腺細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。當(dāng)甲狀腺激素的合成出現(xiàn)障礙，甲狀腺激素水平的下降通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)促進(jìn)垂體釋放TSH，升高的TSH促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞增殖造成甲狀腺腫大，已為眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。對(duì)于單純性甲狀腺腫和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫而言，患者體內(nèi)的甲狀腺激素和TSH水平并沒有明顯變化，一般認(rèn)為是甲狀腺細(xì)胞對(duì)TSH的敏感性增強(qiáng)所致。GraveS病是導(dǎo)致毒性甲狀腺腫的主要因素，其機(jī)制是通過自身刺激性抗體與TSH受體

7、結(jié)合，模擬TSH的效應(yīng)，促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞增殖形成甲狀腺腫。近年來的研究還揭示出在TRS-TSHR信號(hào)傳導(dǎo)通路之外，存在著可以促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞增殖的多種信號(hào)分子，如IGF-1、HGF等。多個(gè)研究表明IGF-1在甲狀腺腫的發(fā)生中起重要作用。 一直以來，甲狀腺腫的治療主要有三種方法：甲狀腺激素、手術(shù)和[3]碘放射性治療。臨床上這三種方法各有其并發(fā)癥和副作用，例如甲狀腺腫大的復(fù)發(fā)、骨量丟失、甲狀腺功能減退及對(duì)心血管的不良影響等。因此，有必要

8、探索新的副作用更少的治療方法。中醫(yī)藥在中國已有兩千多年的歷史，并且正逐步走向世界，因其好的療效、極少的副作用日益受到歡迎?？辜淄枋巧綎|省立醫(yī)院內(nèi)分泌科趙家軍教授治療甲狀腺腫的驗(yàn)方，已獲國家專利，具有益氣活血、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，臨床用以治療單純性甲狀腺腫、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和毒性甲狀腺腫多年，可使腫大的甲狀腺顯著縮小，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。然而其治療甲狀腺腫的具體機(jī)制仍有待深入探討。本研究擬從血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的角度來探討抗甲丸治療甲狀

9、腺腫的機(jī)制。 研究目的： 1.應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型，觀察抗甲丸的抗血管生成效應(yīng)。 2.應(yīng)用組織學(xué)和蛋白印跡等方法，探討抗甲丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響。 3.應(yīng)用免疫組化和蛋白印跡等方法，探討抗甲丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細(xì)胞增殖的影響。 研究方法： 1.雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型 種雞蛋37℃，60％濕度，孵化72小時(shí)。然后將雞蛋取出，小心將雞蛋殼打開，

10、將種蛋的內(nèi)容物放入10×10cm Falcon細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃，60％濕度，4％co2濃度培養(yǎng)2天。將直徑5mm的圓形Whatman定性濾紙，盡量選取血管分布相似的區(qū)域，放到雞胚絨毛尿囊膜上。將藥物加到濾紙上，每天加藥一次，5天后，將雞胚放于體視顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照并計(jì)數(shù)濾紙周邊10mm范圍內(nèi)的血管分支點(diǎn)數(shù)目。 2.實(shí)驗(yàn)性大鼠甲狀腺腫模型制備和實(shí)驗(yàn)分組 雄性wistar大鼠編號(hào)后，隨機(jī)分為4組：正常

11、對(duì)照組，模型對(duì)照組，低劑量抗甲丸治療組和高劑量抗甲丸治療組。后三組在飲水中加入甲巰咪唑誘導(dǎo)甲狀腺腫大直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。飲用甲巰咪唑一周后，后兩組開始灌服抗甲丸，劑量分別為250mg/kg、1000mg/kg，每天一次。同時(shí)模型對(duì)照組給予等量的水灌服。在服用抗甲丸4周、8周、12周時(shí)經(jīng)頸靜脈竇采血測定甲狀腺功能和TSH。服用抗甲丸12周后，大鼠麻醉處死，完整切取甲狀腺組織。一部分放入4％多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片；一部分用3％戊二醛固定

12、，用于電鏡觀察；最后一部分放入液氮中保存，用于蛋白印跡分析。 3.組織學(xué)方法 包括HE染色、電鏡、TUNEL、免疫組織化學(xué)等。同時(shí)用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)微觀形態(tài)和免疫組化的結(jié)果進(jìn)行定量分析。 4.蛋白印跡法 研究結(jié)果： 1.通過雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型的研究，與空白對(duì)照組相比，抗甲丸低、高兩個(gè)劑量組的血管形態(tài)和血管分支點(diǎn)無顯著性差異，未發(fā)現(xiàn)抗甲丸有抑制血管生成的作用。

13、 2.甲巰咪唑誘導(dǎo)形成實(shí)驗(yàn)性大鼠甲狀腺腫，在此模型中，甲狀腺功能明顯改變，TT3、TT4顯著降低，而TSH顯著的升高。未發(fā)現(xiàn)抗甲丸對(duì)大鼠甲狀腺功能和TSH有顯著影響。 3.模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，甲狀腺指數(shù)增長7倍。與模型對(duì)照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組的甲狀腺指數(shù)分別減小10％和21％。低高劑量抗甲丸治療組的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.HE染色表明模型對(duì)照組的甲狀腺細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞及細(xì)胞核肥大，90％以上的

14、的濾泡結(jié)構(gòu)和膠質(zhì)消失。經(jīng)抗甲丸治療后，甲狀腺細(xì)胞數(shù)目減少，濾泡結(jié)構(gòu)和膠質(zhì)有所恢復(fù)。電鏡表明抗甲丸治療組細(xì)胞核破裂、染色質(zhì)邊集和胞漿空泡化等凋亡現(xiàn)象明顯增加。 5.TUNEL的結(jié)果表明低、高劑量抗甲丸治療組的凋亡甲狀腺細(xì)胞數(shù)量顯著多于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。定量分析表明低、高劑量抗甲丸治療組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較模型對(duì)照組比有顯著性差異，高劑量抗甲丸治療組的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)是低劑量抗甲丸治療組的1倍多。 6.活性caspas

15、e-3免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，甲狀腺組織中極少有活性caspase-3的表達(dá)。與模型對(duì)照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組活性caspase-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)高劑量抗甲丸治療組的表達(dá)顯著多于低劑量抗甲丸治療組。蛋白印跡的結(jié)果表明，另外3組較正常對(duì)照組，caspase-3的蛋白表達(dá)分別增加2.7、3.6和5.3倍，表明抗甲丸的治療可以顯著增加caspase-3的蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性。 7.蛋白印跡分

16、析結(jié)果表明Fas在抗甲丸治療組的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與模型對(duì)照組相比，低劑量抗甲丸治療組增加了45％，高劑量抗甲丸治療組則增加了103％。 8.PCNA的免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組PCNA的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。而與模型對(duì)照組相比，低劑量和高劑量抗甲丸治療組的表達(dá)顯著減弱，高劑量抗甲丸治療組的降低更為明顯。蛋白印跡的結(jié)果與免疫組化的結(jié)果一致，PCNA的蛋白表達(dá)在模型對(duì)照組較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而低劑量和高劑量抗

17、甲丸治療組的表達(dá)較模型對(duì)照組分別降低45％和58％。 9.cyclin D1的蛋白印跡結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的cyclin D1的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。而與模型對(duì)照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組cyclin D1的蛋白表達(dá)分別減弱25％和39％，高劑量抗甲丸治療組的減弱更為顯著。 研究結(jié)論： 1.抗甲丸沒有抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成的效應(yīng)。 2.在甲巰咪唑誘導(dǎo)的大鼠甲狀腺腫模型中，抗甲丸可