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文檔簡(jiǎn)介
1、骨髓源性肝干細(xì)胞(Bone marrow derived liver stem cells,BMDLSC)是指骨髓干細(xì)胞中可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群。這類干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。小鼠BMDLSC移植實(shí)驗(yàn)證實(shí),BMDLSC對(duì)CCL4及酒精所致小鼠肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)作用。但是在生理狀態(tài)下定居在骨髓內(nèi)的BMDLSC,為什么在移植后會(huì)向肝臟遷移并發(fā)揮修復(fù)作用,調(diào)控移植后BMDLSC向肝臟遷移的因素又有哪些,它們又是
2、如何調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的,這些問(wèn)題目前都未明了。
近些年來(lái),學(xué)者們發(fā)現(xiàn)趨化因子有可能是驅(qū)使BMDLSC向肝臟遷移的一個(gè)重要因素,其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可以驅(qū)使CXCR4陽(yáng)性的骨髓源性肝干細(xì)胞向肝內(nèi)聚集并誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化[1],我們此前的臨床研究[2]也觀察到SDF-1α在肝臟發(fā)生纖維性增生時(shí)表達(dá)增多,并且表達(dá)數(shù)量與肝纖維化程度相關(guān),提示SDF-1α在人體內(nèi)同樣有可能
3、是趨勢(shì)BMDLSC向肝臟遷移的一個(gè)重要因素。在體外試驗(yàn)中,單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1,系統(tǒng)命名為CCL2)[3,4]、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(Rantes,系統(tǒng)命名為CCL5)[4-6]、人單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3,系統(tǒng)命名為CCL7)[7]、人二級(jí)淋巴組織趨化因子(SLC,系統(tǒng)命名為CCL21)[8]和人胸腺表達(dá)趨化因子(TECK,系統(tǒng)命名為CCL25)[4,9]等趨化因子可以驅(qū)使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向其濃度遞增方
4、向遷移,且趨化能力大小與上述趨化因子的濃度成正相關(guān)。提示這些趨化因子在體內(nèi)也有可能是調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的的因素。但是,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CC125在肝臟的表達(dá)情況至今仍未見(jiàn)報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對(duì)正常肝組織和肝纖維化與肝硬化肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的
5、表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。方法參照人ELISA試劑盒內(nèi)所附的操作說(shuō)明。結(jié)果顯示,肝臟發(fā)生肝纖維性增生損傷時(shí),肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的含量顯著增加,隨著病變由肝纖維化向肝硬化發(fā)展,肝組織中CCL2、CCL5、CCL21和CCL25水平也進(jìn)一步升高,但CCL7水平呈下降趨勢(shì)。
[材料和方法]
1.肝組織 取自30例病人,均來(lái)自2008年5月~2009年5月在南方醫(yī)科大學(xué)南方
6、醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)(包括肝移植)的病人。其中男性17例,女性13例。年齡19~77歲,平均50歲。30例標(biāo)本共分為3組:
①正常對(duì)照組(n=9):乙肝表面抗原陰性,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能正常(轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、血清白蛋白、凝血酶原時(shí)間),Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A級(jí),肝組織病理學(xué)檢查顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常。
②肝纖維化組(n=10):乙肝表面抗原陽(yáng)性,有或無(wú)乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能
7、正?;虍惓?Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A級(jí),組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)纖維化組織增生,但無(wú)假小葉形成。
③肝硬化組(n=11):乙肝表面抗原陽(yáng)性,有或無(wú)乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能檢查輕度至重度異常,Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A~C級(jí),病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)廣泛纖維組織增生,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,假小葉及再生結(jié)節(jié)形成。
2.觀察指標(biāo)與方法
2.1 臨床癥狀與體征 體查確認(rèn)患者
8、有無(wú)黃疸,有無(wú)肝掌與癡蛛痣,有無(wú)腹腔積液,有無(wú)肝性腦病,以及這些癥狀體征的程度。
2.2影像學(xué)檢查 肝臟CT掃描和肝臟B型超聲檢查。
2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 乙肝兩對(duì)半、丙肝抗體試驗(yàn),手術(shù)當(dāng)天抽血查肝臟生化功能指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶原時(shí)間(PT)。
2.4組織病理學(xué)檢查 肝組織經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟至水及HE
9、染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察。
2.5肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量的測(cè)定
2.5.1 肝組織的勻漿、離心 精確稱重肝組織后移入微量手動(dòng)玻璃勻漿器中于低溫環(huán)境中徹底勻漿,按比加入1×PBS緩沖液將勻漿組織沈下并轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中,在低溫高速離心機(jī)中以4℃、1000×g離心力離心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管中,再次于4℃下25000×rpm離心2
10、0min,取上清液待測(cè)。
2.5.2 ELISA法測(cè)定以上五種趨化因子的含量 采用雙抗體夾心ELISA法,即將上述五種趨化因子與包被于酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合后,再結(jié)合生物素化相應(yīng)的趨化因子抗體,加入底物A和B進(jìn)行顯色,在酶標(biāo)儀上讀取450nm的波長(zhǎng)OD值,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的濃度與分別與對(duì)應(yīng)的OD值成比,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合,得到擬合效果最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程
11、,最后求出標(biāo)本離心液中的趨化因子的濃度。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
最終計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。行×列表資料采用x2檢驗(yàn);多組均數(shù)比較,如方差齊性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較;如方差不齊,則采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較;相關(guān)分析數(shù)據(jù)總體符合雙變量正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示,不
12、符合雙變量正態(tài)分布的采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。所有統(tǒng)計(jì)分析中,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
[結(jié)論]
1.本研究的觀察結(jié)果表明,肝臟不僅有CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25表達(dá),而且在肝臟發(fā)生纖維增生性損害時(shí),肝內(nèi)表達(dá)這些趨化因子的數(shù)量顯著增加。隨著肝損傷程度的加重,肝內(nèi)趨化因子的含量逐步增加,至肝纖維化階段,肝內(nèi)CCL7的含量達(dá)到高峰。至肝硬化階段,肝內(nèi)CCL2、CCL5、CCL21、C
13、CL25的含量達(dá)到高峰。但是這些趨化因子在肝臟發(fā)生纖維性損傷時(shí)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的意義及其在BMDLSC向肝臟遷移過(guò)程中的調(diào)控作用有待進(jìn)一步探索。
2.肝內(nèi)趨化因子的含量與肝功能指標(biāo)的相關(guān)分析表明:CCL2、CCL5、CCL21和CCL25在肝臟的表達(dá)數(shù)量與ALT和AST的變化呈顯著性正相關(guān),提示這四種趨化因子在肝臟的表達(dá)水平也可以作為判斷有無(wú)肝臟損傷的指標(biāo)。肝細(xì)胞受到損傷時(shí),肝臟表達(dá)這四種趨化因子的表達(dá)數(shù)量增多;CCL7在肝臟
14、的含量雖然也與ALT和AST的變化呈正相關(guān),但相關(guān)系數(shù)僅0.337和0.380,提示CCL7在肝臟的含量高低與肝臟有無(wú)細(xì)胞損傷的關(guān)系不大,CCL7不能作為判斷有無(wú)肝臟損傷的指標(biāo)。
3.CCL2、CCL5、CCL7、CCL21、CCL25這五種趨化因子之間的相關(guān)性分析顯示,CCL2、CCL5、CCL21、CCL25這四種趨化因子之間相關(guān)系數(shù)均在0.728以上,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示這四種趨化因子的表達(dá)機(jī)制可能存在相似之處;C
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