趨化因子CCL2和長鏈非編碼RNA AVAN抗流感病毒作用機制研究.pdf

1、流感是危害人類健康的重要呼吸道傳染病，曾多次引起全球暴發(fā)流行，奪走數(shù)千萬人生命。流感病毒感染容易造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終導(dǎo)致死亡。研究表明，急性肺損傷的產(chǎn)生，一方面是由于病毒本身，另一方面是由于感染引起的過度免疫反應(yīng)導(dǎo)致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”（cytokine storm）。隨著研究的

2、深入，許多和流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷密切相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子被發(fā)現(xiàn)，但其功能一直存在爭議，并且在禽流感病毒感染中報道甚少，特別是H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷，至今未見報道。
　　隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來越多的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識，其在生命活動中發(fā)揮著重要作用，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、個體發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)等。在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中，雖也有少數(shù)有功能的

3、lncRNA被發(fā)現(xiàn)，但仍存在著大量功能未知的lncRNA，特別是中性粒細(xì)胞lncRNA表達譜，至今未見報道。我們設(shè)想找到一條lncRNA，可在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。
　　基于以上研究背景，我們擬從趨化因子和長鏈非編碼RNA功能和機制為切入點，分別從蛋白水平和RNA水平，探討天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒感染導(dǎo)致的急性肺損傷中的作用，開展以下兩部分研究：
　　一、趨化因子CCL2在甲型 H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急

4、性肺損傷中的作用研究
　　為了建立甲型H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠模型，我們首先利用H7N9禽流感毒株（Ah01株和Hb01株）感染C57BL/6小鼠，從小鼠體重變化和死亡率結(jié)果來評價感染效果，結(jié)果顯示Hb01株毒力較Ah01株強，能夠使小鼠體重顯著下降，并快速誘導(dǎo)小鼠死亡。我們進一步分析了小鼠肺部病理改變和肺部水腫程度，發(fā)現(xiàn)Hb01株H7N9禽流感病毒能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肺損傷，因此我們選擇 Hb01株 H7N9

5、禽流感病毒感染小鼠模型為后續(xù)研究模型。在建模過程中，我們發(fā)現(xiàn)H7N9感染后小鼠的死亡高峰基本在一周出現(xiàn)，與文獻報道的H5N1感染后小鼠死亡情況相似，這提示天然免疫同樣在H7N9感染導(dǎo)致小鼠死亡的過程中發(fā)揮著重要作用。利用獲得性免疫缺陷小鼠（Rag1-/-小鼠）感染H7N9模型，結(jié)果顯示Rag1-/-小鼠感染H7N9后表現(xiàn)出和野生型幾乎相同的死亡率、體重變化以及肺部病理變化，這進一步表明H7N9感染導(dǎo)致小鼠主要在天然免疫階段。
　　

6、為了研究H7N9感染后小鼠的高細(xì)胞因子血癥，我們收集了H7N9感染后第5天小鼠的血清和支氣管肺泡灌洗液，進行細(xì)胞因子和趨化因子表達譜分析，結(jié)果顯示大部分炎性細(xì)胞因子和趨化因子在感染后都有一定程度的升高，其中單核/巨噬細(xì)胞最重要的趨化因子CCL2在小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中都明顯升高，且維持在較高水平。考慮到CCL2的作用及其表達水平，提示CCL2可能在H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷中起到關(guān)鍵的作用。
　　我們進一步檢測了H7N9感

7、染后小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中CCL2的動態(tài)變化，結(jié)果顯示小鼠感染H7N9后，CCL2從第1天開始便出現(xiàn)明顯的上升，其中在支氣管肺泡灌洗液中，CCL2的表達于第7天達峰，第9天開始回落；而在血清中一直呈高表達水平。通過共聚焦實驗，我們也發(fā)現(xiàn)H7N9感染的小鼠肺組織中有大量的CCL2表達，進一步提示了CCL2具有重要的作用。
　　最后，為了明確CCL2在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，我們通過CCL2基因敲除小鼠感染H7N9

8、發(fā)現(xiàn)，CCL2基因敲除后，小鼠的死亡率明顯降低，體重下降減緩，且小鼠肺水腫情況明顯改善，肺損傷得到緩解。同時，我們發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后，支氣管肺泡中的中性粒細(xì)胞募集顯著增加，相反的，單核/巨噬細(xì)胞的募集卻被抑制了。病毒復(fù)制實驗顯示CCL2基因敲除后不能影響H7N9在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。
　　綜上所述，我們首次建立了H7N9感染小鼠致死模型，分析獲得了小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子及趨化因子表達譜，明確了CCL2表達的動態(tài)變化，

9、且發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可有效緩解H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷。我們在進一步實驗中發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可抑制支氣管肺泡中單核/巨噬細(xì)胞的募集，增強中性粒細(xì)胞募集。這些結(jié)果提示我們中性粒細(xì)胞在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷過程中可能起到關(guān)鍵作用，啟發(fā)了我們的下一部分工作，同時也為趨化因子在H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷過程中的研究提供了依據(jù)。
　　二、長鏈非編碼RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用機制研究
　　為

10、了研究lncRNA在天然免疫抗流感病毒中的作用，我們首先利用二代測序檢測了流感病毒感染患者危急重期與其恢復(fù)期的外周血中性粒細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)了全新的差異表達的lncRNA共有433條；經(jīng)過篩選進一步確定了一條全新的lncRNA在病毒感染后顯著高表達，我們將其命名為AVAN(anti-virusand activate neutrophils，AVAN)。我們又利用NB和RACE實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN只有一個轉(zhuǎn)錄本，長度為517核

11、苷酸，通過核質(zhì)分離和RNA-FISH實驗發(fā)現(xiàn)AVAN均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。通過檢測 AVAN在病毒感染后的表達，發(fā)現(xiàn)其表達具有一定的劑量依賴和時間依賴。
　　在此基礎(chǔ)上，我們又開展了AVAN功能研究。首先分析了測序結(jié)果中和AVAN表達相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些mRNA主要和流感病毒復(fù)制以及天然免疫激活相關(guān)。功能獲得和缺失實驗表明AVAN能夠促進I型干擾素的表達，抑制流感病毒復(fù)制；同時，我們也發(fā)現(xiàn) AVAN能夠有效地激活中性粒細(xì)

12、胞，增強中性粒細(xì)胞的趨化性。
　　為了探究AVAN發(fā)揮抗病毒和增強中性粒細(xì)胞活性的具體分子機制，我們首先利用RNA pull down技術(shù)，對差異富集的蛋白進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)AVAN相對于其反義對照序列能夠有效地富集E3泛素連接酶TRIM25；用免疫印跡和RIP實驗進一步驗證AVAN和TRIM25確有直接相互作用。同時，利用IP等實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN可增強TRIM25與RIG-I相互作用，促進RIG-I的泛素化，從而激活了RIG-I信

13、號通路，誘導(dǎo)I型干擾素的表達，抑制流感病毒復(fù)制。
　　考慮到AVAN同TRIM25相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，而AVAN在細(xì)胞核內(nèi)也有大量分布。根據(jù)lncRNA的作用方式，我們推測AVAN可能會通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾，進而影響其他基因的表達發(fā)揮功能?；蚪M定位分析可見，AVAN位于6號染色體，在轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a啟動子區(qū)的反義鏈上。我們構(gòu)建了FOXO3a啟動子區(qū)的雙螢光素酶報告載體，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠增強其螢光素酶活性，我們進一步在轉(zhuǎn)錄水平

14、和蛋白水平都驗證了AVAN能夠明顯地促進FOXO3a的表達。為了明確AVAN是否能夠與FOXO3a的啟動子區(qū)直接結(jié)合，我們利用ChIRP實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠直接結(jié)合到FOXO3a啟動子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）。利用ChIP實驗，我們發(fā)現(xiàn)AVAN能夠影響FOXO3a啟動子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）H3K4me3和H3K27ac兩種組蛋白修飾，以及該區(qū)域RNA聚合酶II的結(jié)合。以上實驗結(jié)果表明AVAN能夠通過反式作用方式

15、來促進FOXO3a的表達。
　　為了進一步全面地了解AVAN對病毒感染后轉(zhuǎn)錄組的變化，我們用流感病毒感染AVAN過表達的細(xì)胞，利用mRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)AVAN上調(diào)表達的基因主要富集在I型干擾素通路以及細(xì)胞因子分泌通路。這進一步證實了我們前面所發(fā)現(xiàn)的AVAN能夠促進I型干擾素的表達和中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。
　　最后，我們利用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體在C57BL/6小鼠體內(nèi)過表達AV

16、AN，然后利用流感病毒感染小鼠，分別從體重變化、死亡率、肺臟的病理改變、水腫程度以及病毒滴度等方面觀察AVAN在小鼠體內(nèi)的作用。我們發(fā)現(xiàn)AVAN過表達后，流感病毒介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的程度明顯得到了緩解，而且肺臟中病毒滴度也有明顯的下降。這證明在流感病毒感染時，AVAN能夠有效地保護小鼠。
　　綜上所述，我們首次獲得了流感病人外周血中性粒細(xì)胞lncRNA表達譜；篩選獲得了一條全新的lncRNA AVAN，并對其做了全面的注釋和認(rèn)識

17、。通過功能實驗發(fā)現(xiàn)AVAN能夠促進I型干擾素的表達而抑制流感病毒復(fù)制，同時AVAN還能夠促進中性粒細(xì)胞激活，增強其趨化性。在分子機制上，AVAN能夠在細(xì)胞質(zhì)中通過與TRIM25相互作用，影響RIG-I信號通路的激活；在細(xì)胞核中，AVAN能夠通過反式作用方式促進FOXO3a的表達，增強中性粒細(xì)胞的活性。在體內(nèi)實驗中，我們證實AVAN能夠有效緩解流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷。此研究為將來篩選新型抗流感病毒RNA藥物提供了依據(jù)。
　　總之，

18、通過以上兩部分實驗，研究了天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，探索了lncRNA在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)的作用及機制，建立了一整套天然免疫抗病毒研究體系，為今后進一步研究其他呼吸道病毒及新發(fā)突發(fā)傳染病奠定了基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL2是甲型H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷的重要因素，同時也鑒定出一條全新的lncRNA AVAN在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，為將來篩選新型抗病毒藥物提供了理論依據(jù)