人趨化因子CCL11和CCL24的表達(dá)、純化及性能表征.pdf

1、趨化因子CCL11和CCL24都屬于β趨化因子或CC趨化因子家族的成員,以近N-端處有2個(gè)相鄰的半胱氨酸為特征。目前越來(lái)越多的研究表明CCL11、CCL24的受體CCR3在炎癥反應(yīng)、過(guò)敏性哮喘等疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是重要的藥物靶點(diǎn),通過(guò)阻斷CCR3的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將有望大大緩解或徹底治愈炎癥及過(guò)敏性哮喘等相關(guān)疾病。作為趨化因子的重要成員,其研究受到了廣泛的關(guān)注。
　　 在大腸桿菌中對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行過(guò)量表達(dá),以獲得毫克至幾十毫克級(jí)具

2、有活性的蛋白,是在體外對(duì)蛋白進(jìn)行深入研究的通常做法。但是,目前,CCL11、CCL24在大腸桿菌中主要是以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),活性較低需要對(duì)其進(jìn)行復(fù)性,步驟繁瑣。為了解決這一問(wèn)題和進(jìn)一步研究CCL11、CCL24的生物化學(xué)、生物物理性質(zhì)及其與受體CCR3間的作用機(jī)制,本論文通過(guò)PCR擴(kuò)增人CCL11、CCL24成熟蛋白的基因,將其插入表達(dá)載體,獲得目的蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化獲得了融合蛋白的最佳表達(dá)條件:即表達(dá)載體選用p

3、ET28a,宿主菌選用大腸桿菌BL21(DE3),CCL11融合蛋白的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600m=1.2～1.4,CCL24融合蛋白的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600m=0.8-1.0,誘導(dǎo)劑濃度為0.5mM IPTG,培養(yǎng)溫度為25℃。經(jīng)Ni2+親和色譜柱、TEV酶切等步驟建立了目的蛋白的純化方法,并通過(guò)SDS-PAGE、Western blot、質(zhì)譜等對(duì)蛋白進(jìn)行初步表征。通過(guò)圓二色光譜儀、熒光光譜儀對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和在變性劑下的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析:C

4、CL11、CCL24均給出預(yù)期的圓二色光譜,表明其已正確折疊;CCL11在7.0M的尿素或5.0M的鹽酸胍中能夠完全變性,而CCL24在7.0M的鹽酸胍才能完全變性,在相同的變性劑濃度下,CCL24在變性劑中的穩(wěn)定性比CCL11高。蛋白在鹽酸胍中的折疊動(dòng)力學(xué)研究表明,CCL11、CCL24的折疊均存在中間態(tài),且其動(dòng)力學(xué)過(guò)程存在明顯差異。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣流實(shí)驗(yàn)和熒光各向異性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)目的蛋白可以和受體CCR3結(jié)合,并引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子釋放,證