CXC趨化因子配體-10表達(dá)、純化及動物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腫瘤是一類常見的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。盡管新型藥物不斷涌現(xiàn)，治療方案不斷更新，化療仍然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療腫瘤的主流。順鉑(DDP)是廣泛使用的一線毒性化療成分。順鉑的使用明顯提高了患者的完全緩解率和長期生存率，但是仍有不少患者由于腫瘤復(fù)發(fā)而死亡，即使是治療持續(xù)進(jìn)行，術(shù)后相當(dāng)比例的患者仍然復(fù)發(fā)。近來一些研究表明，傳統(tǒng)的化療或者放療策略聯(lián)合抗血管治療可以產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。 CXC趨化因子配體10(CXCL10)，又名

2、γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)，主要由干擾素、脂多糖等刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞而產(chǎn)生。在腫瘤中除了展示胸腺依賴性的抗腫瘤作用以外，還是一種有效的血管形成抑制劑。目前研究表明單用CXCL10蛋白或基因治療能有效地抑制腫瘤生長，但并不能造成腫瘤完全消退，提示需要補(bǔ)充藥物直接靶向腫瘤細(xì)胞。CXCL10與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。順鉑通過與DNA鏈結(jié)合，形成交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA、RNA合成。CXCL10和順鉑

3、都具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，兩種藥物的作用機(jī)制和毒性不同，本研究設(shè)想CXCL10聯(lián)合順鉑可以改善腫瘤的治療效果。 方法：本研究首先從InvivoGen公司購買的pBLAST質(zhì)粒上通過PCR擴(kuò)增出人和鼠的CXCL10序列(序列號：人x02530；鼠m33266)，克隆到融合表達(dá)系統(tǒng)pET-32(a)表達(dá)重組蛋白。通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化重組蛋白，重組蛋白質(zhì)定量后按Novagen公司說明，加入腸激酶作酶切。復(fù)性后通過淋巴細(xì)胞趨化活性

4、分析檢測CXCL10生物活性。 在BALB/c(接種結(jié)腸癌CT26細(xì)胞)和C57BL/6小鼠(接種lewis肺腺癌LL/2細(xì)胞)上建立動物模型。荷瘤小鼠隨機(jī)分為CXCL10+DDP組；CXCL10組；DDP組；PBS對照組，CXCL10按25μg/kg/day，皮下注射，連用30天。順鉑采用腹腔內(nèi)注射(5mg/kg)，于CXCL10治療的第14，21天使用，連用兩個(gè)周期。觀察小鼠腫瘤體積和生存時(shí)間。通過藻酸鹽包被實(shí)驗(yàn)和CD31免

5、疫組化觀察腫瘤血管生成情況。通過TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡。同時(shí)觀察蛋白質(zhì)可能的副作用。 結(jié)果：CXCL10克隆到pET-32(a)原核表達(dá)載體上后行酶切鑒定，然后將重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序，證實(shí)所插入CXCL10基因序列與GenBank序列完全一致，開放閱讀框架正確。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2小時(shí)，然后作Tricine-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-PAGE)分析，與誘導(dǎo)前

6、相比，于分子量29KDa處均出現(xiàn)了一條新的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，與預(yù)期分子量大小一致。表達(dá)的CXCL10蛋白質(zhì)主要位于沉淀中，為不溶性的包涵體。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)在A280紫外監(jiān)測儀控制下收集純化的重組蛋白質(zhì)，在200mmol/L咪唑(pH9.0)洗脫時(shí)出現(xiàn)重組蛋白的洗脫峰，作電泳分析和免疫印跡(WesternBlot)證實(shí)為目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。經(jīng)腸激酶切割和復(fù)性后，淋巴細(xì)胞趨化活性分析表明獲得了具有生物活性的重組蛋白，可以用于下一步

7、動物實(shí)驗(yàn)研究。 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白質(zhì)在兩種模型上顯著地抑制了腫瘤生長，使荷瘤小鼠生存期延長，而PBS對照組小鼠生存期明顯縮短，兩組比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性(P＜0.05)。兩種腫瘤模型證實(shí)了CXCL10聯(lián)合順鉑相對單一成分治療更加有效地降低了腫瘤的生長和延長了小鼠的成活時(shí)間，但均無小鼠腫瘤完全消退。治療結(jié)束后4天，摘取Lewis肺癌各組小鼠的肺臟計(jì)算肺表面的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL10治療明顯抑制了LL/2肺轉(zhuǎn)

8、移，在單用CXCL10和聯(lián)合治療組肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)少于對照組(P＜0.05)。HE組織學(xué)切片也顯示CXCL10治療與對照組有明顯差異。單用DDP治療轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)有所減少，但與PBS對照相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性(P=0.12)。 藻酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PBS組可見豐富的不規(guī)則的血管，單用蛋白質(zhì)治療或者聯(lián)合治療組可見周圍及內(nèi)部新生血管明顯少于PBS組，F(xiàn)ITC-Dextran的攝取實(shí)驗(yàn)與此一致，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有顯著性(P＜0

9、.05)。 為進(jìn)一步證實(shí)CXCL10的抗血管作用，各組腫瘤組織微血管密度(MVD)的石蠟切片上免疫組化結(jié)果顯示CD31染色，CXCL10或者聯(lián)合治療組腫瘤組織內(nèi)新生血管明顯少于PBS組(P＜0.05)，單用DDP治療組和PBS組微血管密度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無顯著性(P＞0.05)。 采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)和順鉑聯(lián)合治療組腫瘤組織中熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞明顯高于其他三組(P＜0.01)

10、，單用蛋白質(zhì)CXCL10治療組或單用順鉑治療組細(xì)胞凋亡百分率與對照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異也有顯著性(P＜0.05)。病理切片上聯(lián)合治療組可見腫瘤組織壞死明顯，PBS對照組腫瘤組織只有少量壞死，正常的毛細(xì)血管圍繞著排列混亂的腫瘤細(xì)胞。聯(lián)合治療組和單用CXCL10治療組，鏡下還可以見到比較明顯的免疫細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，免疫組化提示主要為單核細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞，而PBS對照組很少見到免疫細(xì)胞浸潤。 CXCL10單獨(dú)治療中未觀察到動物如

11、體重，卷毛，食欲及活動等變化。ELISA未檢測到血中有抗CXCL10同種異體抗體的存在。重組蛋白治療中除了脾臟輕度增生以外，鏡下未觀察到各器官組織細(xì)胞形態(tài)改變。 這項(xiàng)研究為重組蛋白CXCL10的下一步應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)對進(jìn)一步探索肺癌和結(jié)腸癌的聯(lián)合治療途徑也具有重要意義。聯(lián)合CXCL10和其他的化療藥物或者放療可能也會產(chǎn)生較好的抗腫瘤效果。 結(jié)論：1.構(gòu)建了人與鼠CXCL10重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(D

12、E3)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了融合蛋白； 2.重組蛋白經(jīng)過純化、腸激酶切割、復(fù)性，經(jīng)Tricine-PAGE、免疫印跡(WesternBlot)分析證實(shí)為目的基因表達(dá)的產(chǎn)物；體外趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)對激活的T淋巴細(xì)胞具有趨化作用； 3.證實(shí)了重組蛋白CXCL10單獨(dú)應(yīng)用有抑制腫瘤生長的作用； 4.第一次證實(shí)了聯(lián)合化療藥物順鉑可進(jìn)一步抑制荷瘤小鼠腫瘤生長； 5.證實(shí)了CXCL10抗腫瘤作用與抑制腫瘤血管形成有關(guān)；