TLR4通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞損傷為主要特征的慢性、自身免疫性、膽汁淤積性肝病。該病以中老年女性多發(fā)，病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。大量證據(jù)表明，PBC是以遺傳為基礎(chǔ)，由遺傳和環(huán)境相互作用而產(chǎn)生的。一些臨床和流行病學(xué)研究提示，泌尿道感染等因素可能與PBC的發(fā)病密切相關(guān)，是PBC發(fā)病的危險(xiǎn)因素，但現(xiàn)有的研究結(jié)果并不完全一致，甚至個(gè)別研究的結(jié)果截然相反。因此，關(guān)于泌尿道

2、感染與PBC的關(guān)系有待進(jìn)一步確認(rèn)。
　　 毫無(wú)疑問，大多數(shù)PBC最終會(huì)發(fā)展成為肝纖維化和肝硬化，但能否進(jìn)展成為肝癌，或者說PBC患者肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)是否較一般人群顯著升高尚存在很大爭(zhēng)議。其原因主要是個(gè)體研究的方法學(xué)、樣本數(shù)量、統(tǒng)計(jì)效能等問題。循證醫(yī)學(xué)研究可以對(duì)當(dāng)前的所有相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析，研究結(jié)果可以為臨床提供最高層次和最具可信性的證據(jù)。但是，到目前為止，關(guān)于PBC與肝癌的相關(guān)性尚沒有進(jìn)行循證醫(yī)學(xué)研究。
　　

3、如果能夠證實(shí)泌尿道感染是PBC的一個(gè)病因，而PBC又是發(fā)生肝癌的高危因素，那么感染在PBC向肝硬化、肝癌發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制就是一個(gè)急需解決的問題。有研究提示，PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(intrahepatic biliary epithelialcells，IBECs) TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，可能參與PBC的發(fā)病。泌尿道感染主要是革蘭陰性細(xì)菌，其主要成分為脂多糖(LPS)。因此，我們有理由推測(cè)，LPS-TLR4通路在PBC向肝硬

4、化、肝癌發(fā)展過程中具有重要作用。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)以上推測(cè)，我們進(jìn)行了下面的研究:一、通過循證醫(yī)學(xué)手段證實(shí)泌尿道感染與PBC的關(guān)系;二、通過循證醫(yī)學(xué)手段證實(shí)PBC是肝癌的一個(gè)高危因素;三、從臨床水平探討TLR4與EMT（該過程是PBC向肝纖維化、硬化發(fā)展的一個(gè)重要步驟）的相關(guān)性及在PBC中的意義;四、探討LPS-TLR4通路對(duì)IBEC發(fā)生EMT的誘導(dǎo)作用及其具體機(jī)制。
　　 第一部分原發(fā)性膽汁性肝硬化危險(xiǎn)因素的循證醫(yī)學(xué)

5、研究
　　 我們主要通過PUBMED、EMBASE、Cochrane圖書館和中國(guó)各種醫(yī)學(xué)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，按照以下標(biāo)準(zhǔn)納入相關(guān)文獻(xiàn):(1)報(bào)告了相對(duì)危險(xiǎn)度RR和OR，并且提供了95％可信區(qū)間的觀察性研究;(2)病例對(duì)照研究和隊(duì)列研究;(3)獨(dú)立的研究，沒有重復(fù)報(bào)告相同人群。應(yīng)用隨機(jī)或固定效應(yīng)模型進(jìn)行薈萃分析，探討各種危險(xiǎn)因素與PBC的相關(guān)性。
　　 經(jīng)過篩查鑒定，我們納入5篇相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析。5篇文

6、獻(xiàn)均為英文文獻(xiàn)，包含1913例PBC患者和4697例健康對(duì)照。5項(xiàng)研究均涉及吸煙與PBC的相關(guān)性，4項(xiàng)研究涉及泌尿道感染與PBC的相關(guān)性，3項(xiàng)研究涉及家族史和甲狀腺疾病與PBC的相關(guān)性，2項(xiàng)研究涉及飲酒、染發(fā)、扁桃體切除手術(shù)、懷孕年齡、激素治療、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和濕疹與PBC的相關(guān)性。薈萃分析結(jié)果顯示，泌尿道感染、吸煙和家族史與PBC的發(fā)生密切相關(guān)，泌尿道感染患者患PBC的危險(xiǎn)度OR=2.02(95％CI:1.4-2.65);吸煙

7、患PBC的危險(xiǎn)度OR=1.67（95％CI:1.41-1.92）;具有PBC家族史人群患PBC的危險(xiǎn)度OR=7.56(95％CI:1.9-13.22)。而甲狀腺疾病與PBC的發(fā)病沒有顯著相關(guān)性O(shè)R=3.08(95％CI:0.84-5.32)。為進(jìn)一步確認(rèn)研究結(jié)果的穩(wěn)定性，我們對(duì)納入的研究進(jìn)行了出版偏倚評(píng)價(jià)。Egger檢驗(yàn)和Begger's funnel圖分析結(jié)果均表明，納入的研究不存在出版偏倚，提示研究結(jié)果還是比較穩(wěn)定的。這部分研究結(jié)果

8、提示，泌尿道感染是PBC的一個(gè)重要病因。
　　 第二部分原發(fā)性膽汁性肝硬化與肝癌相關(guān)性的循證醫(yī)學(xué)研究
　　 為探討PBC與肝癌的關(guān)系，證實(shí)PBC是肝癌的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，我們?cè)诒静糠謶?yīng)用系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析的方法探討了PBC與肝癌的相關(guān)性。我們主要通過PUBMED、EMBASE和Cochrane圖書館進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，按照以下標(biāo)準(zhǔn)納入相關(guān)文獻(xiàn):(1)隊(duì)列研究或病例對(duì)照研究;(2)將PBC作為一個(gè)暴露因素的研究;(3)將腫瘤作為

9、一個(gè)結(jié)果的研究;(4)給出RR值及其95％可信區(qū)間或能夠計(jì)算出二者的相關(guān)數(shù)據(jù)的研究;(5)獨(dú)立的沒有重復(fù)的研究。如果多個(gè)研究報(bào)道相同人群或部分相同人群，我們僅納入最新或數(shù)據(jù)最全的研究。
　　 我們從3510篇文獻(xiàn)中篩選、納入16篇文獻(xiàn)，包括17個(gè)個(gè)體研究，其中有一篇文獻(xiàn)報(bào)告了兩組隊(duì)列研究，一組是西班牙人群，另一組是意大利人群。我們對(duì)17個(gè)個(gè)體研究進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析。這17個(gè)個(gè)體研究共包含16368名PBC患者。9個(gè)研究報(bào)告

10、了PBC與所有腫瘤的危險(xiǎn)關(guān)系;12個(gè)研究報(bào)告了PBC與肝癌危險(xiǎn)的關(guān)系，9個(gè)研究報(bào)告了PBC與乳腺癌危險(xiǎn)的關(guān)系;5個(gè)研究報(bào)告了與腎癌危險(xiǎn)的關(guān)系;5個(gè)研究報(bào)告了與結(jié)腸癌危險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示，與一般人群相比，PBC患者患所有腫瘤的相對(duì)危險(xiǎn)度RR值為1.55(95％CI:1.28-1.83)，即PBC患者患所有腫瘤的危險(xiǎn)比一般人群要高55％。PBC患者患肝癌的危險(xiǎn)度RR值為18.8(95％CI:10.81-26.79)，即PBC患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)

11、比一般健康人群高17.8倍。通過亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)在各個(gè)亞組PBC均可以顯著增高肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。只有兩個(gè)亞組例外，分別是美國(guó)人群和以人群為基礎(chǔ)的研究。雖然在這兩個(gè)亞組中，PBC患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)仍然是一般人群的8倍以上（美國(guó)人群是23.88倍，以人群為基礎(chǔ)的研究是8.61倍），但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不顯著，這種情況的出現(xiàn)可能主要是因?yàn)檫@兩個(gè)亞組所包含的研究數(shù)量太少（均為3篇），而且異質(zhì)性很高，缺少統(tǒng)計(jì)效能。此外，與其他腫瘤發(fā)病危險(xiǎn)性的薈萃分析結(jié)果

12、顯示，PBC與乳腺癌、腎癌等腫瘤的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性，對(duì)乳腺癌進(jìn)行亞組分析的結(jié)果顯示在各亞組中，PBC均與乳腺癌的發(fā)生沒有密切關(guān)系。
　　 這部分研究結(jié)果表明，PBC與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是肝癌發(fā)生的一個(gè)高危因素。由于肝纖維化和肝硬化是肝癌的重要原因，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在纖維化疾病中具有重要作用。結(jié)合第一部分的研究，LPS-TLR4通路異常活化是否誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化？其具體機(jī)制如何？我們將在第三、四部分進(jìn)行探討。
　　

13、 第三部分TLR4及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的表達(dá)及臨床意義
　　 為進(jìn)一步探討TLR4和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞EMT與PBC向纖維化進(jìn)展的關(guān)系以及二者在PBC進(jìn)展過程中的關(guān)聯(lián)，我們?cè)诒静糠盅芯恐袘?yīng)用免疫組化的方法從臨床水平檢測(cè)了TLR4及EMT相關(guān)蛋白在PBC患者肝組織門管區(qū)膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)。我們收集PBC患者肝穿和肝活檢標(biāo)本共11例，其中病理1期2例，2期3例，3期2例，4期4例，同時(shí)收集5例供肝者肝組織切

14、片標(biāo)本作為正常對(duì)照。采用免疫組化的方法檢測(cè)各組細(xì)胞角蛋白CK19、TLR4、E-鈣粘蛋白及波形蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CK19在正常人及PBC患者膽管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且陽(yáng)性率隨著PBC分期增高而明顯降低。TLR4和波形蛋白在正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞幾乎無(wú)表達(dá)，1期PBC患者陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.6％和30.0％，2期患者平均陽(yáng)性率為41.6％和40.1％，3期患者平均陽(yáng)性率為64％和73.7％，4期患者平均陽(yáng)性率為73.1％和77.0

15、％。兩兩比較的結(jié)果顯示，除1，2期及3，4期外，其余各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。E-鈣粘蛋白在正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而在PBC患者表達(dá)明顯降低，1期PBC患者E-鈣粘蛋白平均陽(yáng)性率為84％，2期患者平均陽(yáng)性率為48.1％，3期患者平均陽(yáng)性率為23％，4期患者平均陽(yáng)性率為19％。兩兩比較的結(jié)果顯示，除正常對(duì)照與1期以及3，4期外，其余各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。此外，PBC患者TL

16、R4陽(yáng)性表達(dá)率與E-鈣粘蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)rs=-0.927，P＜0.01），TLR4與波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)rs=0.918，P＜0.01），波形蛋白與E-鈣粘蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)rs=-0.918，P＜0.01）。
　　 因此，PBC患者肝組織門管區(qū)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)明顯增高，而且按照PBC的組織學(xué)分期，TLR4隨著PBC纖維化嚴(yán)重程度的加深而表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PBC

17、患者肝組織門管區(qū)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白表達(dá)明顯降低、波形蛋白表達(dá)明顯增高，這種變化也是隨著PBC纖維化嚴(yán)重程度的加重而更加明顯，提示在PBC向纖維化方向發(fā)展的過程中會(huì)出現(xiàn)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞EMT現(xiàn)象，且與TLR4表達(dá)密切相關(guān)。
　　 那么，在PBC的進(jìn)展過程中，TLR4對(duì)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞EMT是否具有誘導(dǎo)作用及其具體機(jī)制，我們將在第四部分通過體外培養(yǎng)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞進(jìn)行深入探討。
　　 第四部分TLR4通路對(duì)肝內(nèi)膽管

18、上皮細(xì)胞EMT的作用機(jī)制
　　 為進(jìn)一步闡明TLR4通路異?；罨赑BC進(jìn)展過程中作用機(jī)制，我們擬在本部分研究中體外培養(yǎng)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，利用刮痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、MyD88及Snail小干擾RNA、抑制劑阻斷、Western blot、螢光素酶報(bào)告等實(shí)驗(yàn)方法深入探討LPS—TLR4信號(hào)通路活化對(duì)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用及其具體分子機(jī)制。結(jié)果顯示10ug/ml LPS刺激肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞2

19、4小時(shí)后，細(xì)胞遷移明顯高于對(duì)照組，經(jīng)過Transwell小室遷移的細(xì)胞數(shù)為110.4±9.17，明顯高于對(duì)照組(75.8±7.78)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，10ug/ml，50ug/ml及100ug/ml LPS作用24小時(shí)，與對(duì)照組比較，E-鈣粘蛋白基因表達(dá)明顯降低，S100A4基因表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示10ug/ml LPS作用24小時(shí)，E-鈣粘蛋白表

20、達(dá)明顯降低，S100A4蛋白表達(dá)明顯升高。轉(zhuǎn)染MyD88 SiRNA后，經(jīng)10ug/ml LPS刺激24h，刮痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移相對(duì)距離明顯低于單獨(dú)LPS刺激組，Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示遷移細(xì)胞數(shù)為85.6±8.97，明顯低于LPS刺激組，且轉(zhuǎn)染MyD88 SiRNA組與單獨(dú)加入LPS組比較，E-鈣粘蛋白基因和蛋白表達(dá)明顯升高，S100A4基因和蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 應(yīng)用抑制劑PD

21、TC、SB203580及SP600125預(yù)刺激后加入10ug/ml LPS刺激24小時(shí)，與單獨(dú)加入LPS組比較，E-鈣粘蛋白基因表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);抑制劑SB203580預(yù)刺激后，S100A4及Snail基因表達(dá)比單獨(dú)加LPS組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各組Slug基因表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 經(jīng)10ug/ml LPS刺激24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染Snail SiRNA組E-鈣粘蛋白基因表達(dá)比未

22、轉(zhuǎn)染組明顯增高，S100A4基因表達(dá)比未轉(zhuǎn)染組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10ug/ml LPS刺激轉(zhuǎn)染野生型載體的肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，相對(duì)螢光值比對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，加入AP-1抑制劑100uM6-姜酚后，相對(duì)螢光值明顯降低，而轉(zhuǎn)染突變型載體組差異無(wú)明顯變化。
　　 通過本部分研究，可以推測(cè)LPS通過TLR4-MyD88-P38-AP1-Snail的途徑誘導(dǎo)肝

23、內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，為PBC向纖維化、硬化發(fā)展的機(jī)理提供了一種可能的解釋，為進(jìn)一步探討如何逆轉(zhuǎn)PBC向纖維化方向發(fā)展提供一種可能的潛在靶點(diǎn)。
　　 綜上所述，通過以上四部分的研究，我們初步提出PBC發(fā)生發(fā)展的一個(gè)可能機(jī)制，即:泌尿道感染-LPS-TLR4通路異常活化-肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞EMT-肝纖維化、硬化-肝癌。這對(duì)于有效預(yù)防或避免PBC的危險(xiǎn)因素，尋找治療PBC的潛在靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PBC的合理預(yù)防、有效治療或病情逆轉(zhuǎn)具有重