TAM信號通路在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者中的表達水平及其對巨噬細胞極化的影響.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是機體一類重要的器官特異性的自身免疫性疾病，其主要病理特征為肝臟門管區(qū)小葉間膽管上皮細胞發(fā)生變性、壞死及炎癥細胞浸潤引起的肝內小膽管進行性破壞伴門脈炎癥性改變，最終導致膽汁淤積，隨著病程進展，肝臟發(fā)生纖維化，最終演變成肝硬化，肝癌甚至肝衰竭
　　而對于PBC具體的發(fā)病機制，當前還不是十分清楚，已知突變的易感基因主要集中于多條免疫信號通路，這些信號通路與

2、免疫細胞功能密切相關如骨髓細胞分化、抗原遞程、T細胞分化、B細胞抗體分泌及NK細胞促炎因子的產生等;膽管上皮細胞是PBC肝臟病變的重要靶細胞，膽管上皮細胞損傷是PBC發(fā)病機制中重要的一環(huán);研究認為膽管上皮細胞表達的T細胞配體是引起膽管上皮細胞損傷的重要原因，而膽管上皮細胞凋亡新生抗原也被證實與PBC膽管特異性損傷密切相關;此外，膽管上皮細胞還可以行使抗原遞程細胞的功能，進一步放大自身炎癥免疫損傷。
　　我們應以動態(tài)地眼光來探討PB

3、C特定階段的發(fā)病機制，探尋不同病理階段潛在的治療靶點，最終實現(xiàn)對PBC更加針對、更加有效地治療。
　　基于TAM信號通路、巨噬細胞極化與PBC的潛在聯(lián)系，我們擬通過本研究探討二者在PBC中的作用;主要擬解決以下幾個問題:第一，探討TAM受體與配體在包括PBC在內的相關自身免疫性疾病的mRNA表達水平;第二，分析游離的TAM受體家族分子在PBC患者中水平及其臨床意義;第三，探討PBC患者巨噬細胞極化水平的變化以及與Mer受體表達水平

4、的相關性;第四，初步探討Mer受體在PBC中調控巨噬細胞極化的潛在生物學機制。
　　第一部分 TAM受體家族在自身免疫性疾病中的mRNA表達水平及其臨床意義
　　在本部分研究中，我們納入了原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合癥以及健康對照者，使用RT-PCR方法對比分析上述幾類自身免疫性疾病患者外周血單個核細胞中TAM受體及其配體的mRNA表達水平并分析其表達水平與患者的臨床特征間的相關性;結果

5、顯示TAM受體家族分子無論受體還是配體在自身免疫性疾病的外周血單個核細胞中均存在不同程度的異常表達，在類風濕性關節(jié)炎患者中Gas6與Tyro-3、Axl呈現(xiàn)顯著的低表達水平，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中Gas6、ProteinS、Ax1顯著低表達且這種低表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病嚴重程度及炎癥反應水平密切相關;而在PBC患者中，ProS與Ax1的表達水平顯著地降低，但與PBC患者的臨床特征無顯著相關性;該部分研究結果說明在自身免疫性疾病中

6、TAM受體家族存在不同程度地低表達水平，基于TAM受體信號通路的功能進一步反映該信號通路在自身免疫性疾病發(fā)病機制中潛在的作用。
　　第二部分 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清游離TAM受體家族分子水平及其臨床意義;
　　本部分研究中，我們檢測了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清中游離TAM受體家族分子(sTAM)的濃度水平，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中ProS濃度顯著降低(102.1±10.0ug/ml vs108.6±5.6ug/ml，p＜0.

7、01)，而sMer、sTyro-3的濃度水平在PBC患者血清中顯著的高于健康對照者(21.1±7.5ug/ml vs17.1±2.65ug/ml;8.51±4.0ug/mlvs5.18±1.74ug/ml)，臨床相關性分析結果顯示:sMer水平與PBC患者的AKP、GGT、TBA水平呈現(xiàn)顯著的正相關性(r=0.33，p＜0.01;r=0.65，p＜0.01;r=.73，p＜0.01)，同樣，sTyro-3的濃度水平與AKP、GGT、TB

8、A呈現(xiàn)顯著的正相關性(r=0.48，p＜0.01;r=0.49，p＜0.01;r=.49，p＜.01)，進而說明在肝功能較差的PBC患者中游離的sMer、sTyro3水平要顯著增加;隨后的診斷試驗顯示sTyro-3在PBC中的診斷ROC曲線下面積達到0.77(95％cCI0.69-0.85)，敏感度達0.70，特異度為0.78，其中Cutoff值為6.30ug/ml; sMer的ROC曲線下面積為0.66(95％CI0.56-0.76)

9、，敏感度達0.63，特異度為0.72，其中Cutoff值為17.7ug/ml;ProS的ROC曲線下面積為0.68(95％CI0.59-0.78)，敏感度達0.87，特異度為0.47，其中Cutoff值為103.1ug/ml;由此可見，血清中游離地TAM受體家族分子在PBC的診斷中具有重要地臨床意義。
　　第三部分 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單核巨噬細胞中TAM膜受體表達水平、巨噬細胞極化情況及二者之間的相關性;
　　在本

10、部分研究中，我們主要分析了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單核巨噬細胞極化情況，流式結果顯示在早期PBC患者中M1型巨噬細胞(CD68+/CCR2+)的比例要顯著高于晚期PBC患者(p＜0.05); M2型巨噬細胞(CD163+/CX3 CR1+)在晚期PBC患者外周血中比例要顯著高于早期PBC患者(p＜0.05);由于不同極化類型的巨噬細胞分泌特異性細胞因子，為了進一步驗證PBC患者外周血M1與M2型巨噬細胞分布情況，我們檢測了TNF-α

11、、IL-12、TGF-β、IL-10的濃度水平;結果顯示在早期PBC患者中IL-12水平顯著高于晚期PBC患者(129.7±51.3pg/mlvs87.8±23.9pg/ml， p＜0.01)，而TGF-β水平顯著低于晚期PBC患者(5384.0±4055.8pg/mlvs14182.8±10894.6pg/ml;p=0.02);由于TNF-α、IL-12為M1型巨噬細胞特異性細胞因子，而TGF-β、IL-10為M2型巨噬細胞特異性細胞

12、因子，進一步證實PBC不同階段的M1/M2分型情況。此外，本部分使用流式細胞術檢測了不同階段PBC患者與健康對照者外周血單核巨噬細胞群中TAM膜受體(mTAM)表達水平，在早期PBC患者中mMer水平顯著低于晚期PBC患者(p＜0.01)，而對于其它兩個膜受體mTyro-3、mAx1在早晚期PBC患者中未見明顯差異;基于不同階段PBC患者中M1與M2型巨噬細胞比例以及TAM膜受體表達水平，我們進一步分析了M2/M1比值與mMer、mTy

13、ro-3、mAx1的相關性;結果顯示mMer與M2/M1比值呈現(xiàn)顯著正相關(r=0.57，p＜0.01)，即M2巨噬細胞比例隨著mMer表達升高而增加;此外，我們對M2/M1比值與PBC患者的臨床特征進行了相關性分析，分析結果顯示:M2/M1比值與DBIL、AKP水平呈現(xiàn)正相關性(r=081，p＜0.01; r=0.71，p＜0.01)，即PBC患者血清中DBIL、AKP水平隨著外周血M2/M1比值的升高而增加;本部分研究證實PBC患者

14、外周血中巨噬細胞極化情況與mMer水平密切相關。
　　第四部分 初步探討Mer對巨噬細胞極化的調節(jié)作用及其潛在生物學機制;
　　本部分研究中，我們初步探討了TAM受體在巨噬細胞極化過程中的生物學機制;使用siRNA-Mer下調M0型巨噬細胞Mer表達后共培養(yǎng)凋亡膽管上皮細胞與M0型巨噬細胞，通過流式細胞術檢測M2型巨噬細胞比例:在未加入siRNA-Mer組中，CD163+/CX3CR1+細胞比例顯著高于加入siRNA-Mer

15、，從而可知Mer表達水平可以有效促進M2型巨噬細胞方向極化;除了流式細胞術檢測M2型巨噬細胞表型，為了進一步說明Mer受體對M2巨噬細胞極化的影響，同時檢測了M2型巨噬細胞特異性基因包括CD206、CCL18、RANTES、MDC的表達以及特異性細胞因子TGF-β、VEGF、IL-10、TNF-α、IL-12的表達水平;結果顯示CCL18及RANTES的表達水平在siRNA-Mer干擾后顯著降低，而M2型巨噬細胞因子TGF-β、IL-1

16、0的表達水平顯著的同樣顯著降低;隨后進一步分析siRNA-Mer對M2型巨噬細胞極化調控過程中的相關信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)在轉染不同濃度的siRNA-Mer后巨噬細胞中總Akt蛋白水平無明顯改變，而磷酸化Akt蛋白水平顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性;隨后使用Akt激動劑SC79模擬p-Akt功能后檢測細胞培養(yǎng)液上清中M2型巨噬細胞比例，結果顯示Akt激動劑SC79可以有效的中和siRNA-Mer對M2型巨噬細胞極化的抑制作用;結合上述M2型巨

17、噬細胞表型、M2型特異性基因與細胞因子的水平變化，我們認為Mer主要通過影響下游信號通路Akt的磷酸化水平(p-Akt)，進而調控M2型巨噬細胞極化;此外，siRNA-Mer可以降低細胞培養(yǎng)上清中IL-10、IL-13的表達水平，而同時加入SC79后細胞上清上IL-10、IL-13水平顯著升高;綜合以上研究結果，本部分研究認為Mer受體能夠促進M2型巨噬細胞極化，而其潛在的生物學機制是Mer受體通過調控p-Akt信號通路進而影響M2型巨