LAMP-2在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的臨床意義及其參與膽汁排泄的機(jī)制探討.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種慢性進(jìn)行性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病，最終可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化。PBC在世界各地均有分布，各年齡段均可發(fā)病，尤其好發(fā)于中年女性。西方國家報(bào)道的發(fā)病率較高。近年來，由于對PBC認(rèn)識程度和疾病診斷水平的提高，我國報(bào)道的PBC病例數(shù)也呈大幅度上升趨勢。
　　熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是美國食品藥品監(jiān)督管理局（food

2、and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的目前可用于PBC治療的唯一藥物。研究發(fā)現(xiàn)長期使用UDCA可有效改善患者的各項(xiàng)指標(biāo)，延緩疾病進(jìn)展，減少肝硬化發(fā)生，降低肝移植需求率，提高患者的生存率。但仍有約1/3的患者對UDCA不應(yīng)答，<40歲的PBC患者不應(yīng)答率甚至超過50％。因此，早期發(fā)現(xiàn)那些UDCA不應(yīng)答或部分應(yīng)答的PBC患者具有重要的臨床意義。
　　溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosome-associated m

3、embrane protein2，LAMP-2）是我們率先發(fā)現(xiàn)的PBC相關(guān)分子，前期研究發(fā)現(xiàn)LAMP-2對PBC病理診斷具有重要意義，且其在PBC肝臟組織中的表達(dá)與疾病病理分期正相關(guān)。但LAMP-2分子的確切功能尚待深入研究，尤其是其在PBC等膽汁淤積性疾病中的作用目前還不清楚。
　　本研究共分三部分：1）鑒于肝穿病理檢查的局限性和有創(chuàng)性，從血清學(xué)角度出發(fā)，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorben

4、t assay，ELISA）檢測PBC患者血清中的 LAMP-2含量，進(jìn)一步結(jié)合患者臨床相關(guān)指標(biāo)的變化，分析血清LAMP-2在PBC臨床中的意義，尤其是其對PBC患者UDCA生化應(yīng)答的評估價(jià)值。2）為了深入了解LAMP-2分子在PBC等膽汁淤積性疾病中的作用，借助轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALENs），構(gòu)建LAMP-2基因敲除大鼠模型，

5、并對該模型鼠的膽汁淤積表型進(jìn)行鑒定。3）以所建的LAMP-2基因敲除大鼠模型為工具，探討LAMP-2與肝細(xì)胞膽汁淤積的關(guān)系，以及LAMP-2參與肝細(xì)胞膽汁排泄的可能機(jī)制。
　　第一部分應(yīng)用血清LAMP-2評價(jià)PBC患者UDCA應(yīng)答的臨床研究
　　目的：
　　UDCA是美國FDA批準(zhǔn)的目前可用于PBC治療的唯一藥物。研究發(fā)現(xiàn)長期使用UDCA可有效改善患者的各項(xiàng)指標(biāo)，延緩疾病進(jìn)展，減少肝硬化發(fā)生，降低肝移植需求率，提高患者

6、的生存率，但仍有約1/3的患者對UDCA不應(yīng)答。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LAMP-2在PBC患者肝臟組織中的表達(dá)與患者疾病病理分期正相關(guān)。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上探討PBC患者血清LAMP-2水平與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系，尤其是血清LAMP-2在評估患者UDCA生化應(yīng)答方面的價(jià)值。
　　方法：
　　該回顧性研究納入了自2007年至2013年就診于我院（第四軍醫(yī)大學(xué)，西京消化病醫(yī)院）的新診斷 PBC患者102例。所有患者均接受 UDCA治

7、療，治療劑量為13~15 mg/kg/day。采集患者治療前和治療后1、3、6和12個(gè)月時(shí)的全血標(biāo)本，收集血清。同時(shí)收集相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的隨訪資料，其中包括肝穿病理檢查結(jié)果和臨床相關(guān)檢測指標(biāo)，如總膽紅素、ALP、GGT、AST、ALT、ALB和IgM等。研究同時(shí)納入了經(jīng)由我院診斷的乙肝患者126例、丙肝患者114例，肝內(nèi)膽汁淤積患者（包括自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、藥物性肝病、Gilbert's病和Dubin-Johnson綜合征）2

8、7例，以及未發(fā)現(xiàn)明顯異常的健康對照者84例。各對照組年齡和性別均與PBC患者保持組內(nèi)平衡。所有對照者均收集有治療前的血清標(biāo)本，以及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的隨訪資料。利用ELISA方法檢測PBC患者及對照者血清中的LAMP-2含量，進(jìn)一步分析血清LAMP-2在PBC臨床中的意義。
　　結(jié)果：
　　1）治療前PBC患者血清 LAMP-2水平明顯高于乙肝患者、丙肝患者、肝內(nèi)膽汁淤積患者以及健康對照者。
　　2）治療前不同PBC亞群患者血

9、清LAMP-2水平不同，其中以晚期患者（III-IV期）和膽紅素>1mg/dL的患者血清LAMP-2升高最明顯。
　　3）治療前PBC患者血清LAMP-2水平不能獨(dú)立反映UDCA療效。
　　4）PBC患者接受UDCA治療后，血清LAMP-2降低趨勢與肝臟相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢一致，并在UDCA治療3個(gè)月時(shí)降低即很明顯。
　　5）PBC患者接受UDCA治療后，應(yīng)答患者血清LAMP-2降低更明顯。
　　6） UDCA治療

10、3個(gè)月時(shí)，PBC患者血清LAMP-2下降有助于患者UDCA應(yīng)答的判讀。
　　結(jié)論：
　　PBC患者接受 UDCA治療3個(gè)月時(shí)，血清 LAMP-2的下降有助于評判患者對UDCA的應(yīng)答。
　　第二和三部分 LAMP-2參與肝細(xì)胞膽汁排泄的機(jī)制研究
　　目的：
　　LAMP-2分子在多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但該分子的確切功能尚待深入探討。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝臟組織中LAMP-2表達(dá)與患者疾病進(jìn)展密

11、切相關(guān)，血清LAMP-2變化對評判PBC患者UDCA生化應(yīng)答具有重要價(jià)值。本部分的研究目的在于探討LAMP-2在膽汁淤積性疾病中的作用，以及LAMP-2參與肝細(xì)胞膽汁排泄的可能機(jī)制。
　　方法：
　　利用TALENs技術(shù)構(gòu)建LAMP-2基因敲除大鼠模型，并以建立的基因敲除大鼠模型為工具，通過體內(nèi)研究探討 LAMP-2與肝細(xì)胞膽汁淤積的關(guān)系，以及 LAMP-2參與肝細(xì)胞膽汁排泄的可能機(jī)制。體外構(gòu)建LAMP-2過表達(dá)及LAMP-

12、2 RNAi干擾細(xì)胞模型，并以所建細(xì)胞模型為工具，對體內(nèi)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　借助TALENs技術(shù)，成功構(gòu)建了LAMP-2基因敲除大鼠模型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：
　　1）LAMP-2基因敲除大鼠肝臟表現(xiàn)有膽汁淤積的現(xiàn)象。
　　2）LAMP-2基因敲除大鼠對膽汁淤積的耐受性降低，更易發(fā)生膽汁排泄障礙。
　　3）相對和絕對定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and a

13、bsolute quantitation，iTRAQ）差異分析結(jié)果顯示，LAMP-2基因敲除大鼠肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜轉(zhuǎn)運(yùn)體異常改變。
　　4）LAMP-2基因敲除大鼠肝臟毛細(xì)膽管膜上與膽汁排泄直接相關(guān)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，Mrp2）表達(dá)異常。
　　5）LAMP-2基因敲除大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LAMP-2通過調(diào)控 Mrp2在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜