小檗堿降糖調(diào)脂作用與PPARs-P-TEFb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系.pdf

1、目的： 觀察小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠血糖血脂和肝臟、骨骼肌中糖脂代謝，以及脂肪組織中PPARs和P-FEFb的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。篩選最佳小干擾RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)序列，在最佳干擾濃度和時(shí)間下沉默CDK9mRNA表達(dá)，3T3-L1細(xì)胞中PPARα、PPARδ、：PPARγ、CDK9、cyclinT1mRNA和蛋白的改變及小檗堿的干預(yù)作用。旨在探討小檗堿對(duì)2型糖尿病的治療作用及其改善糖

2、脂代謝作用與PPARs/P-TEFb表達(dá)的關(guān)系，闡明小檗堿治療糖尿病的作用機(jī)制。 方法： 1.2型糖尿病大鼠模型的建立：大鼠禁食12h后用于建立2型糖尿病模型，根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ)劑量為35mg/kg，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)2周，挑選空腹血糖值≥16.7mmol/L的糖尿病大鼠改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)14周以誘導(dǎo)高脂血癥，正常對(duì)照組大鼠一直用標(biāo)

3、準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。 2.實(shí)驗(yàn)分組及給藥：于16周將空腹血糖值≥16.7mmol/L的糖尿病大鼠按血糖值隨機(jī)分為糖尿病模型組、小檗堿低、中、高劑量組(75、150、300mg/kg)、非諾貝特組(100mg/kg)和羅格列酮組(4mg/kg)6組，非諾貝特和羅格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥。實(shí)驗(yàn)共分7組，其中正常對(duì)照組由同批次正常大鼠組成，每組10只動(dòng)物。大鼠單籠飼養(yǎng)，每天拌食給藥1次，連續(xù)給藥16周，每4周測(cè)1次空腹血糖，每2周稱(chēng)1次體重，并根

4、據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。 3.2型糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰島素等血液指標(biāo)的檢測(cè)：處死大鼠前禁食12h，麻醉后心臟取血，每組5只大鼠用4％多聚甲醛灌注固定后取組織稱(chēng)重再固定，進(jìn)行后續(xù)處理；另5只大鼠直接快速取組織稱(chēng)重后液氮凍存或固定后石蠟包埋。按相應(yīng)方法進(jìn)行血中血糖、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Totalcholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(Highdensitylipoproteincho

5、lesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)、載脂蛋白(Apolipoprotein，Apo)AI、ApoB、游離脂肪酸(Freefattyacid，F(xiàn)FA)、血清胰島素、糖化血紅蛋白(HemoglobinA1c，HbA1c)、總脂酶、腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)和脂聯(lián)素等指標(biāo)的檢測(cè)。 4.觀察

6、胰島普通、超微病理結(jié)構(gòu)和胰島素的表達(dá)：HE染色法觀察胰島的普通病理結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)用透射電鏡技術(shù)觀察胰島的超微病理結(jié)構(gòu)變化。采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)胰島內(nèi)胰島素的表達(dá)，使用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)胰腺中的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)活性和丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量。 5.肝臟和骨骼肌中糖脂代謝的檢測(cè)：油紅O染色法觀察肝臟冰凍切片中脂質(zhì)分布情況，過(guò)碘酸-希夫(氏)(PAS)染色法觀察肝臟中糖

7、原的分布情況。用糖原、FFA、TG檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定肝臟和骨骼肌中糖原、FFA、TG含量。 6.脂肪組織中PPARs、P-TEFbmRNA和蛋白表達(dá)等的測(cè)定：分別采用realtimePCR和westernblotting檢測(cè)脂肪組織中PPARα、PPARδ、PPARγCDK9、cyclinT1mRNA和蛋白的表達(dá)。按相應(yīng)方法檢測(cè)脂肪組織中的TNF-α、脂聯(lián)素、FFA、總脂酶、SOD和MDA等指標(biāo)。采用HE染色觀察脂肪組織細(xì)胞的大

8、小和數(shù)量。 7.3T3-L1脂肪細(xì)胞的增殖、分化和脂質(zhì)集聚：培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，運(yùn)用MTT法和油紅O染色法觀察小檗堿對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞分化情況及采用westernblotting檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記物aP2蛋白的表達(dá)。 8.3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARs、P-TEFb表達(dá)的檢測(cè)：3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclinT1mRNA、蛋白表達(dá)、TNF-α、脂聯(lián)素

9、含量、細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)集聚的測(cè)定，以及在小檗堿、非諾貝特和羅格列酮作用下上述指標(biāo)的變化。 9.最佳RNA干擾(RNAi)條件的確定：采用熒光標(biāo)記的FAM-siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，運(yùn)用realtimePCR技術(shù)篩選最佳CDK9的siRNA序列，確定最有效siRNA沉默基因的最佳干擾濃度和時(shí)間，并觀察siRNA轉(zhuǎn)染后CDK9蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化。 10.RNAi下3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARs、P-TEFb表達(dá)的檢測(cè)：

10、應(yīng)用最有效siRNA序列的最佳干擾濃度轉(zhuǎn)染，在沉默CDK9基因情況下，PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclinT1表達(dá)、TNF-α、脂聯(lián)素含量、細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)集聚的改變，以及在小檗堿、非諾貝特和羅格列酮作用下這些指標(biāo)的變化。 結(jié)果： 1.2型糖尿病大鼠的空腹血糖、HbAlc較正常對(duì)照大鼠升高，TG、TC、LDL-C、ApoB和FFA與正常對(duì)照大鼠比較明顯增高，HDL-C、ApoAI則降低，血清胰島

11、素較正常對(duì)照大鼠升高，表明成功建立了2型糖尿病大鼠模型。 2.小檗堿能明顯降低2型糖尿病大鼠血糖和HbAlc水平，降低TG、TC、LDL-C、ApoB、FFA含量和增加HDL-C、ApoAI含量。小檗堿還可增加糖尿病大鼠肝臟和骨骼肌中糖原含量并降低FFA、TG含量。 3.小檗堿明顯降低糖尿病大鼠血清胰島素含量，提高胰島素敏感指數(shù)和增加β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量；增加胰腺重體重比值，HE染色顯示小檗堿增加胰島面積和β細(xì)胞數(shù)量，透射

12、電鏡結(jié)果表明小檗堿使胰島β細(xì)胞中分泌顆粒數(shù)量上升，改善病變的超微結(jié)構(gòu)；小檗堿增強(qiáng)胰腺中SOD活性和降低MDA含量。 4.小檗堿明顯降低糖尿病大鼠血清和脂肪組織中FFA、MDA、TNF-α含量，增加脂聯(lián)素含量，增強(qiáng)總脂酶和SOD活性，具有促進(jìn)脂質(zhì)代謝、抗氧化和調(diào)節(jié)脂肪因子分泌的功能。 5.小檗堿明顯增強(qiáng)糖尿病大鼠脂肪組織中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclinT1mRNA、蛋白的表達(dá)，降低內(nèi)臟脂肪重比重

13、比值和脂肪細(xì)胞大小，增加脂肪細(xì)胞數(shù)量。 6.小檗堿在低濃度時(shí)促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞增殖和在高濃度時(shí)抑制其增殖，能濃度依賴(lài)性地促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和降低脂質(zhì)積聚。小檗堿可促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclinT1mRNA、蛋白的表達(dá)，抑制TNF-α分泌而增加脂聯(lián)素分泌。 7.siRNAa為最佳沉默CDK9基因表達(dá)序列，最佳干擾濃度和時(shí)間分別為50nmol/L和48h。轉(zhuǎn)染后48hCD

14、K9蛋白表達(dá)明顯減弱，96h恢復(fù)至正常水平。 8.在最有效siRNA序列最佳干擾濃度和時(shí)間條件下沉默CDK9基因表達(dá)，3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclinT1mRNA、蛋白表達(dá)均受到抑制，TNF-α分泌增加而脂聯(lián)素分泌受到抑制。小檗堿對(duì)干擾效應(yīng)具有翻轉(zhuǎn)作用，能促進(jìn)PPARs和P-TEFb表達(dá)，降低TNF-α分泌和促進(jìn)脂聯(lián)素分泌，促進(jìn)細(xì)胞分化和降低脂質(zhì)集聚。 結(jié)論： 本研

15、究一次性腹腔注射小劑量鏈脲菌素，造成部分胰島β細(xì)胞破壞，使其發(fā)生糖尿病，接著采用高糖高脂飼料喂飼以誘發(fā)糖尿病大鼠的高脂血癥。該模型不僅表現(xiàn)胰島素抵抗，而且部分胰島β細(xì)胞功能受損，糖脂代謝紊亂明顯，與人類(lèi)2型糖尿病病理機(jī)制相似，因此用來(lái)評(píng)價(jià)降糖調(diào)脂藥物的療效，結(jié)果可信。小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠具有明顯的降糖調(diào)脂作用，除降低血糖、HbAlc水平和改善血脂代謝異常，還增加骨骼肌和肝糖原含量和降低脂質(zhì)在肝臟、骨骼肌組織中的堆積。小檗堿能促進(jìn)胰島β

16、細(xì)胞再生和增加β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量。小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝的平衡和恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能來(lái)改善胰島素抵抗，引起血清胰島素水平的降低。小檗堿通過(guò)使糖尿病大鼠脂肪組織中降低了的PPARα、PPARδ、PPARγCDK9、cyclinT1表達(dá)恢復(fù)至接近正常大鼠水平，從而改善糖尿病大鼠的糖脂代謝。小檗堿能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞分化和降低脂質(zhì)積聚，其作用與通過(guò)促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclinT1表達(dá)相關(guān)

17、，與糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。RNAi下沉默CDK9基因，3T3-L1細(xì)胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclinT1表達(dá)受到抑制，小檗堿具有翻轉(zhuǎn)并促進(jìn)表達(dá)的作用。因此CDK9參與PPARs的表達(dá)調(diào)控，在PPARs與P-TEFb共同參與脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)集聚中有著重要作用，小檗堿可部分地通過(guò)影響CDK9參與脂肪細(xì)胞的分化功能，進(jìn)而影響PPARs活性，使組織中糖脂代謝活動(dòng)及相關(guān)酶、脂肪因子等恢復(fù)至接近常態(tài)，最終使2型糖