胸腺淋巴細胞分化與Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系及六味地黃湯的作用研究.pdf

1、本研究重點觀察了SAMP8增齡過程中胸腺淋巴細胞免疫功能的動態(tài)變化過程，進而研究了Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號分子基因表達與胸腺淋巴細胞分化的關(guān)系，并初步觀察了LW及其拆方對正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細胞亞群及Notch通路信號分子基因表達的影響，其目的在于探討衰老過程中免疫系統(tǒng)的衰老與Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，從而進一步認識免疫衰老的機理及發(fā)展過程。 本研究分為四個部分：(1)增齡過程中SAMP8胸腺結(jié)構(gòu)和T細胞功能的變化

2、；(2)增齡過程中SAMP8胸腺淋巴細胞分化的動態(tài)變化；(3)增齡過程中SAMP8胸腺淋巴細胞Notch通路信號分子基因表達的動態(tài)變化；(4)LW及其拆方“三補(SB)”和“三瀉(SX)”對正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細胞亞群及Notch通路信號分子基因表達的影響。 一、增齡過程中SAMP8胸腺結(jié)構(gòu)和T細胞功能的變化胸腺是中樞免疫器官，是T細胞分化成熟的場所，衰老過程中胸腺的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯變化，以胸腺增齡性萎縮表現(xiàn)尤為明顯。

3、胸腺萎縮又不可避免地影響依賴于胸腺的T細胞分化，進而影響向外周淋巴器官輸出成熟T細胞的數(shù)量和功能。因此，本研究首先觀察了SAM增齡過程中胸腺組織結(jié)構(gòu)和胸腺淋巴細胞增殖反應(yīng)的變化。 實驗結(jié)果表明，SAMR1和SAMP8出生后胸腺均逐漸增大，至4周齡時體積最大，此后開始萎縮，8周齡時萎縮已十分明顯。在4周齡以前，SAMP8胸腺重量和組織結(jié)構(gòu)與SAMR1相比無明顯差異。6周齡時SAMR1和SAMP8的胸腺重量均有所減輕，SAMP8更為

4、明顯，其重量明顯低于SAMR1。組織切片可見SAMP8胸腺皮質(zhì)明顯變薄，細胞數(shù)量減少；8周齡時SAMP8胸腺重量進一步下降，胸腺皮質(zhì)明顯變薄，細胞數(shù)量進一步減少。上述結(jié)果表明，SAMP8胸腺萎縮明顯早于SAMR1，萎縮程度明顯重于SAMR1。 進一步觀察了增齡過程中SAM胸腺淋巴細胞增殖反應(yīng)的變化。結(jié)果表明，6周齡前SAMR1和SAMP8胸腺淋巴細胞增殖反應(yīng)均表現(xiàn)為隨增齡而增強，6到8周齡無明顯變化；1、2周齡時SAMR1和SA

5、MP8間無明顯差異，自4周齡開始，SAMP8胸腺淋巴細胞增殖反應(yīng)能力明顯低于同齡SAMR1，提示其功能開始降低。 二、增齡過程中SAMP8胸腺淋巴細胞亞群分化的動態(tài)變化小鼠胸腺淋巴細胞的分化過程主要是由CD4-CD8-雙陰性(Doublenegative，DN)到CD4+CD8+雙陽性(Doublepositive，DP)、再到CD4+(Singlepositive，SP)或CD8+單陽性的過程，其中CD4+單陽性是T輔助性細胞

6、(helperTlymphocyte，Th)，CD8+單陽性主要是T抑制性細胞(suppressorTlymphocyte，Ts)和細胞毒性T細胞(CytotoxicTlymphocyte，Tc)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD8+單陽性細胞中也含有具有輔助功能的T細胞亞系。此外，目前普遍認為，CD28是免疫細胞衰老的標志性分子。因此，本研究運用流式細胞技術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)，觀察了增齡過程中SAM胸腺淋巴細胞亞群的變第3頁

7、化。 結(jié)果表明，在增齡過程SAMR1和SAMP8胸腺細胞分化的動態(tài)過程相似。與同齡SAMR1相比，SAMP8胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞的比例變化過程無明顯差異，CD4+單陽性細胞的比例在6周齡前與SAMR1無明顯差異，在8周齡時低于SAMR1，但CD8+單陽性細胞比例在4周齡時開始明顯高于同齡SAMR1，因而導(dǎo)致其CD4+/CD8+比值降低，提示4周齡時SAMP8開始出現(xiàn)免疫功能平衡失調(diào)。此外，1至8周齡SAMP8胸腺細胞CD2

8、8分子的表達量均明顯高于同齡的SAMR1。提示SAMP8胸腺細胞的衰老程度明顯高于SAMR1，可能是其亞群分化失調(diào)和功能低下的重要原因之一。 三、SAMP8增齡過程中胸腺淋巴細胞Notch通路信號分子基因表達的動態(tài)變化 本研究應(yīng)用流式細胞術(shù)和實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，Real-timequa

9、ntitativeRT-PCR)檢測了不同周齡SAMP8和SAMR1胸腺淋巴細胞Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Notch1、PS1、PS2、HES1基因mRNA表達的動態(tài)變化，并分析了它們與CD8+細胞動態(tài)變化的相關(guān)性。 研究結(jié)果表明，SAM在增齡過程中胸腺細胞Notch通路信號分子的基因表達發(fā)生了相應(yīng)的變化，其中Notch1、PS2、HES1的表達隨增齡逐漸增加，而PS1則隨增齡逐漸降低；對CD8+細胞比例與上述信號分子基因表達進行相

10、關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD8+細胞的分化與Notch1、PS2、HES1表達變化呈正相關(guān)的關(guān)系，而與PS1基因表達呈負相關(guān)的關(guān)系，提示衰老過程中胸腺淋巴細胞亞群的分化與Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號分子的表達具有密切關(guān)系，不同信號分子對胸腺細胞分化具有不同的調(diào)節(jié)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8胸腺細胞Notch1的表達在1至8周齡時均明顯高于同齡SAMR1，PS2和HES1基因均自4周齡起明顯高于同齡SAMR1，而PS1基因自4周齡起則明顯低

11、于同齡SAMR1。提示Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號分子基因表達異常可能是導(dǎo)致增齡過程中SAMP8胸腺細胞功能衰退、亞群分化異常的重要原因之一。 四、LW及其拆方對不同小鼠胸腺淋巴細胞亞群及Notch通路信號分子基因表達的影響 1.LW及其拆方對正常小鼠胸腺淋巴細胞亞群及Notch通路信號分子基因表達的影響 (1)對正常小鼠胸腺淋巴細胞亞群及CD28表達的影響分別口服給予4周齡Ba1b/c小鼠LW(5、10及20g

12、/kg)、SB(6.4g/kg)和SX(3.6g/kg)，連續(xù)2周，然后觀察胸腺淋巴細胞亞群的變化。結(jié)果表明，LW及SB和SX對正常小鼠CD4+CD8+細胞和CD4+細胞的比例均無明顯影響；三個劑量的LW均使胸腺CD8+細胞的比例明顯增高，其中以10g/kg劑量的作用最明顯，并使CD4+/CD8+比值明顯降低。SB和SX對CD8+細胞比例無明顯影響。LW在低、中劑量時以及SB和SX均能使胸腺淋巴細胞CD28表達增加，其中以LW低劑量時作

13、用最強，大劑量LW對此則無明顯影響。 (2)對正常小鼠胸腺淋巴細胞Notch通路信號分子基因表達的影響LW及SB、SX的給藥劑量和方式同上。結(jié)果表明，LW(5、10及20g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)對正常小鼠胸腺淋巴細胞Notch1和PS1基因表達水平無明顯影響。但三個劑量的LW均使PS2和HES1基因的表達水平明顯增高，且具有一定的量效關(guān)系；SB和SX對PS2、HES1基因的表達水平無明顯影響。

14、 2.LW及其拆方對SAMP8胸腺淋巴細胞亞群及Notch通路信號分子基因表達的影響 (1)對SAMP8胸腺淋巴細胞亞群及CD28表達的影響本實驗觀察了口服給予LW及SB、SX對4周齡SAMP8胸腺淋巴細胞亞群的影響。實驗結(jié)果表明，連續(xù)4周口服給予LW(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，對SAMP8胸腺CD4+CD8+細胞比例無明顯影響。LW可使SAMP8胸腺CD4+細胞比例有所增加，但無統(tǒng)計

15、學(xué)差異；SB和SX對CD4+細胞比例無明顯影響。LW及SB可明顯降低SAMP8胸腺CD8+細胞比例，使CD4+/CD8+比值增高，但SX對CD8+細胞比例無明顯影響。此外，LW、SB及SX均能明顯增加CD28的表達，其中以SB(6.4g/kg)的作用最強，LW次之。 (2)對SAMP8胸腺淋巴細胞Notch通路信號分子基因表達的影響觀察口服給予LW及SB、SX對Notch通路信號分子基因表達影響的實驗結(jié)果表明，連續(xù)4周口服給予L

16、W(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，對SAMP8胸腺淋巴細胞Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的四種信號分子的基因表達具有不同的作用。LW、SB及SX對Notch1和PS1基因表達水平無明顯影響，但可不同程度地降低PS2和HES1基因的表達水平，其中以LW的作用最強。 以上結(jié)果表明，LW使正常小鼠胸腺CD8+細胞的比例明顯增高，CD4+/CD8+比值明顯降低，但其卻使SAMP8胸腺CD8+細胞比例明顯降低，

17、CD4+/CD8+比值增高，SB對SAMP8的影響與LW相似，表明LW對正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細胞亞群的分化具有不同的的作用。在對胸腺淋巴細胞Notch通路信號分子基因表達的影響上，LW使正常小鼠的PS2和HES1基因表達水平明顯增高，但LW、SB及SX則使SAMP8的PS2和HES1基因表達水平明顯降低，表明LW及其SB、SX拆方對正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細胞的Notch通路信號分子基因的表達也具有不同的影響，但分別與對胸腺