槐定堿致癇大鼠海馬細(xì)胞ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的： 建立同步觀察行為學(xué)和腦電波變化的槐定堿致癇大鼠癲癇模型，觀察清醒狀態(tài)下槐定堿致癇大鼠行為學(xué)和腦電波的變化；探討絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2) 通路及其活化形式—磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在槐定堿致癇大鼠海

2、馬細(xì)胞的表達(dá)變化規(guī)律及其意義，進(jìn)而探討該通路在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法： ①Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和槐定堿致癇組，通過(guò)腦立體定位儀將自制埋藏電極植入大鼠海馬一周后，腹腔注射槐定堿（sophoridine，SRI)建立急性化學(xué)點(diǎn)燃癲癇大鼠模型，對(duì)其行為學(xué)和腦電圖上的癇性放電進(jìn)行同步觀察。②S D大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、槐定堿致癇組、苯巴比妥鈉（phenobarbital sodium

3、，PBS）﹢槐定堿組和PD98059﹢槐定堿組，應(yīng)用免疫組化染色方法檢測(cè)各組大鼠致癇后0.5h、1.5h、5.0h、8.0h海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)ERK1、ERK2和p-ERK1/2的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的變化和應(yīng)用Western blot方法進(jìn)一步檢測(cè)各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬該三種蛋白表達(dá)規(guī)律；同時(shí)采用HE染色方法和電鏡技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)的改變。 結(jié)果： 1.行為學(xué)及大鼠清醒腦電圖表現(xiàn)槐定

4、堿致癇組大鼠腹腔注射槐定堿后,大鼠由活動(dòng)狀態(tài)逐漸變得安靜,隨后出現(xiàn)呆滯,部分動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促，經(jīng)8.46±1.62min的潛伏期后,大鼠逐漸出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作表現(xiàn)。開(kāi)始出現(xiàn)須動(dòng)、點(diǎn)頭、咀嚼樣動(dòng)作，尾巴翹起,濕狗樣抖動(dòng)，伴流涎,至0.5h左右開(kāi)始有面肌抽動(dòng)、雙前肢抬起陣攣或單肢抽搐,隨后出現(xiàn)姿勢(shì)失衡，跌倒，陣攣抽搐，繼之發(fā)生全身強(qiáng)直，持續(xù)36.84±5.69min，點(diǎn)燃率達(dá)100﹪，達(dá)到Ⅳ級(jí)以上發(fā)作的成功率為80％，死亡率為20％。在大鼠癇性

5、發(fā)作的同時(shí)腦電圖出現(xiàn)頻發(fā)性尖波單棘波，棘波、棘慢波，發(fā)作性節(jié)律波等癲癇樣放電。生理鹽水對(duì)照組大鼠腦電圖均為基礎(chǔ)波，且無(wú)癲癇樣放電。槐定堿致癇大鼠癲癇發(fā)作過(guò)程中伴有與行為相一致的清醒腦電圖改變。 2.海馬神經(jīng)元組織病理學(xué)的改變光鏡觀察各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元HE染色標(biāo)本：生理鹽水對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)正常?；倍▔A致癇組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元損傷最嚴(yán)重，壞死損傷區(qū)表現(xiàn)

6、為細(xì)胞核固縮，核仁不明顯，胞漿濃縮深染，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的變性壞死。苯巴比妥鈉﹢槐定堿組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)可見(jiàn)少部分變性或壞死的細(xì)胞，損傷程度較槐定堿致癇組輕。PD98059﹢槐定堿組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)可見(jiàn)散在個(gè)別神經(jīng)元損傷，比槐定堿致癇組和苯巴比妥鈉﹢槐定堿組損傷程度輕。 3.海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變電鏡下觀察各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化：生理鹽水對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)

7、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常。槐定堿致癇組，致癇0.5h海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元核膜雙層結(jié)構(gòu)尚清楚，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，線粒體內(nèi)膜部分損傷,嵴斷裂，致癇1.5h核膜雙層結(jié)構(gòu)破壞,神經(jīng)細(xì)胞核嚴(yán)重固縮,染色質(zhì)顆粒狀聚集,線粒體腫脹,嵴斷裂或消失,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，致癇后5.0h、8.0h損傷仍很重。苯巴比妥鈉﹢槐定堿組少部分神經(jīng)細(xì)胞核輕度固縮，損傷程度較槐定堿致癇組輕。PD98059﹢槐定堿組大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞核輕度固縮，損傷程度比

8、槐定堿致癇組和苯巴比妥鈉﹢槐定堿組輕。 4.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)免疫組化染色結(jié)果生理鹽水對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)有少量的ERK1和ERK2表達(dá)，p-ERK1/2僅在胞漿內(nèi)表達(dá)弱陽(yáng)性，致癇0.5h p-ERK1/2表達(dá)迅速增強(qiáng)，在神經(jīng)元的胞核胞漿內(nèi)都有表達(dá),與生理鹽水對(duì)照組比較 ERK1和ERK2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P﹤0.05)，ERK1主要表

9、達(dá)在胞核胞漿內(nèi)，ERK2主要表達(dá)在胞漿內(nèi)，在致癇1.5 h時(shí)該三種蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高值,5.0h時(shí)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量回降，8.0h繼續(xù)回降，但仍高于生理鹽水對(duì)照組。苯巴比妥鈉﹢槐定堿組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯低于槐定堿致癇組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P﹤0.05)，PD98059﹢槐定堿組顯著抑制ERK表達(dá)，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量低于槐定堿致癇組和苯巴比妥鈉﹢槐定堿組（P﹤0.05）。 5.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)

10、蛋白激酶(p-ERK1/2)Western blot結(jié)果經(jīng)光密度定量分析顯示：生理鹽水對(duì)照組大鼠海馬表達(dá)少量的ERK1和ERK2，而p-ERK1/2蛋白含量更少，致癇0.5h 該三種蛋白含量開(kāi)始升高，1.5h蛋白含量達(dá)到最高值，5.0h后逐漸回降，三種蛋白表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化染色結(jié)果一致?；倍▔A致癇組與生理鹽水對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較蛋白含量顯著增高（P﹤0.05），苯巴比妥鈉﹢槐定堿組蛋白含量明顯低于槐定堿致癇組，PDPD98059﹢槐定堿