APRIL及其受體在宮頸癌細胞中的表達以及APRIL突變體的制備.pdf

1、APRIL(aproliferation-inducingligand，增殖誘導配體)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一。有膜結(jié)合型和可溶性兩種活性形式。APRIL的105-250氨基酸區(qū)域為天然可溶性APRIL(solubleAPRIL，sAPRIL)，其與全長(即膜結(jié)合型)APRIL具有相同的生物學活性，二者在體外均可以促進多種腫瘤細胞系的增殖。APRIL在正常組織中表達量很低，但在多種腫瘤細胞株和腫瘤組織如結(jié)直腸癌、乳腺癌

2、、肺癌、血液系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、膀胱癌中有高水平表達。 作為一種配體蛋白，APRIL通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮促瘤效應(yīng)。B淋巴細胞成熟抗原(Bcellmaturationantigen，BCMA)和跨膜激動子和鈣信號修飾環(huán)親素配體作用子(transmembraneactivatorandcalciumsignal-modulatingcyclophilinligandinteractor，TACI)是目前公認的APRIL受體。最近有

3、報道表明，粘蛋白多糖(syndecans，S)可能也是APRIL的受體。 目前研究尚無APRIL與宮頸癌或其細胞株增殖之間有否關(guān)聯(lián)的報道。本研究擬觀察sAPRIL是否具有促進宮頸癌細胞株HeLa增殖的作用，并對HeLa細胞及宮頸癌組織、癌前病變組織中的APRIL及其受體mRNA的表達情況以及APRIL蛋白在宮頸癌組織的表達情況進行研究，在此研究的基礎(chǔ)上設(shè)計制備sAPRIL的兩個突變體，觀察突變體在體外對HeLa細胞增殖的影響以及

4、對野生型sAPRIL的競爭抑制作用，從而為進一步了解APRIL在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用以及針對抑制APRIL的抗宮頸癌制劑的制備奠定基礎(chǔ)。 為了了解APRIL在宮頸癌發(fā)病中的作用，本研究用RT-PCR及免疫組化檢測了宮頸癌、癌前病變中APRILmRNA及蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中APRIL的mRNA和蛋白的表達均顯著高于癌前病變和正常組織。同時我們用RT-PCR檢測了組織中APRIL受體mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)與正常組

5、織及癌前病變比較，癌組織中BCMA、FACI及粘蛋白多糖-4(S4)的表達水平無顯著差異，而隨著細胞異型性的加重，粘蛋白多糖-1(S1)表達逐漸下降，而粘蛋白多糖-2(S2)的水平逐漸增高。 之后我們用RT-PCR法檢測了HeLa細胞中APRIL及其受體mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞表達APRIL、S1和S2，而不表達BCMA、TACI及S4。 為了進一步了解APRIL在宮頸癌發(fā)病中的作用，我們用BrdU-ELIS

6、A法檢測了sAPRIL蛋白對人宮頸癌細胞株HeLa細胞增殖的作用，發(fā)現(xiàn)sAPRIL蛋白能以劑量依賴的方式促進HeLa細胞的增殖。 鑒于APRIL有促進宮頸癌細胞株HeLa細胞增殖的作用，抑制APRIL的功能活性，將可能為宮頸癌的治療提供新途徑。研究表明APRIL抗體和APRIL的可溶性受體能夠在一定程度上抑制APRIL的功能，但是人源性抗體獲得困難，而APRIL的受體多，一種可溶性受體并不能起到抑制APRIL與其他受體結(jié)合而起作

7、用的功能。因此本課題擬從改建APRIL分子本身入手，構(gòu)建能夠與受體結(jié)合但不能引發(fā)受體后促瘤效應(yīng)的APRIL突變體，以期獲得APRIL的抑制劑，達到治療腫瘤的目的。 本課題借鑒改建BLyS(B-lymphocytestimulator，B淋巴細胞刺激因子)分子的方法，在與BlyS進行同源序列比對以及對APRIL分子進行結(jié)構(gòu)分析后，選擇APRIL第186、187位氨基酸作為突變位點，以pUC19/sAPRIL為模板，用一步反向PCR

8、致突變法構(gòu)建了人msAPRIL-1(186G187Q置換為186K187G)及msAPRIL-2(186G被K置換，187Q缺失)兩個突變體DNA序列；將上述測序正確的突變型目的片段連接于原核表達載體pQE-80L，成功構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pQE-80L/msAPRIL-1和pQE-80L/msAPRIL-2；將重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導，獲得了較高水平的表達，SDS-PAGE分析可見，兩重組蛋白的大小

9、約為19kDa，主要是以包涵體的形式存在，Westernblotting分析顯示，兩蛋白均在分子量約19kDa處出現(xiàn)單一條帶；經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)及尿素透析，兩重組蛋白得到了有效純化和復性。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。經(jīng)SephadexG-75凝膠過濾層析得到兩重組突變體蛋白三聚體分子。生物學功能分析顯示，所制備的msAPRIL-1突變體蛋白能很好地與HeLa細胞結(jié)合，而msAPRIL-2與HeLa細胞只有微弱的結(jié)合

10、；同時兩突變體均不能促細胞增殖。進一步分析顯示msAPRIL-1可以抑制野生型sAPRIL對HeLa細胞的促增殖作用。 本研究主要結(jié)果總結(jié)如下： 一、APRIL及其受體在宮頸鱗癌組織和細胞株中的表達 1.APRIL在宮頸鱗癌組織無論在mRNA還是在蛋白水平的表達均顯著高于正常鱗狀上皮和鱗狀上皮內(nèi)病變，隨著細胞的增殖與異型性的加重表達水平逐漸增高；S1mRNA隨著宮頸鱗狀上皮細胞的增殖和異型性的加重表達逐漸下調(diào)，而

11、S2mRNA表達逐漸增高；BCMA、TACI及S4mRNA在正常組織、炎癥、癌前病變、原位癌及浸潤癌中的表達無顯著差異； 2.宮頸癌HeLa細胞有APRIL、S1及S2mRNA的表達，而不表達BCMA、TACI及S4的mRNA； 二、sAPRIL在體外以劑量依賴方式促進人宮頸癌細胞株HeLa細胞的增殖。 通過以上兩方面的結(jié)果，可初步得出如下結(jié)論：APRIL及其受體在宮頸癌的發(fā)展中可能起一定的作用，其中APRIL在

12、宮頸癌中的作用可能是通過與S1和/或S2結(jié)合而發(fā)揮的；而S1mRNA的降低和/或S2mRNA及APRIL的表達升高可能可以作為病情進展的預警指標。 三、成功制備了sAPRIL的兩個突變體 1.以APRIL第186、187位氨基酸作為突變位點，用一步反向PCR致突變法成功構(gòu)建了人msAPRIL-1DNA(186G187Q置換為186K187G)及msAPRIL-2DNA(186G被K置換，187Q缺失)兩個突變體序列。

13、 2.將突變目的DNA片段連接于原核表達載體pQE-80L，成功構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pQE-80L/msAPRIL-1和pQE-80L/msAPRIL-2。 3、將重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌：DH5α，經(jīng)IPTG誘導，使重組突變體蛋白獲得了成功表達。 4.經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)及尿素透析，兩重組蛋白得到了有效純化和復性；經(jīng)SephadexG-75凝膠過濾層析得到了兩重組突變體蛋白三聚體分子。 四、

14、突變體的功能分析 1.所制備的msAPRIL-1突變體可特異地與HeLa細胞結(jié)合，而msAPRIL-2與HeLa細胞的結(jié)合能力很弱。 2.msAPRIL-1和msAPRIL-2均喪失了促HeLa細胞增殖的功能。 3.msAPRIL-1突變體能在一定程度上競爭抑制野生型sAPRIL促HeLa細胞增殖的功能，而msAPRIL-2的作用則不明顯。 以上三、四兩部分的結(jié)果提示，msAPRIL-1及其衍生分子可能在