穩(wěn)定表達(dá)TNF-α及其突變體基因的人源細(xì)胞模型的建立.pdf

1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一種重要的炎癥因子，主要由激活的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α在機(jī)體的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中起著重要作用，控制著細(xì)胞分化、增殖與凋亡。它以兩種形式存在：26kDa的膜型TNF-α（mTNF-α）與17kDa的可溶型TNF-α（sTNF-α），sTNF-α由mTNF-α酶解而來(lái)。兩型TNF-α通過(guò)與兩型受體（TNFR1與TNFR2）結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，但兩型

2、TNF-α的胞毒作用方式和機(jī)制不盡相同。此外，mTNF-α除了作為配體與TNFR結(jié)合后向靶細(xì)胞傳遞正向信號(hào)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)外，還可同時(shí)作為受體向效應(yīng)細(xì)胞傳遞反向信號(hào)（reverse signaling）。
　　 本室前期工作已經(jīng)建立了能分泌含三種TNF-α基因（野生型TNF-α、膜型TNF-α突變體和分泌型TNF-α突變體）的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞。本研究首先培養(yǎng)這三株包裝細(xì)胞，分別收集高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染自身TNF-α表達(dá)

3、量極低的人骨肉瘤細(xì)胞系（MG63），用G418篩選兩輪得到穩(wěn)定表達(dá)wTNF-α、mTNF-α和sTNF-α蛋白的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究?jī)尚蚑NF-α的生物學(xué)功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等提供實(shí)驗(yàn)工具。
　　 一、鑒定MG63細(xì)胞TNF-α的表達(dá)
　　 同等條件下分別提取MG63細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的總mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后，取相同量的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果證實(shí)：MG63細(xì)胞中TNF-αmRNA水平極低，明顯低

4、于HL-60細(xì)胞。同時(shí)，在相同條件下分別提取MG63細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示HL-60細(xì)胞可見(jiàn)明顯的TNF-α條帶，MG63細(xì)胞僅出現(xiàn)一條微弱的條帶，而兩者的β-actin蛋白量一致，提示MG63細(xì)胞的TNF-α表達(dá)量很低。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：MG63細(xì)胞的TNF-α表達(dá)量為0.53%；ELISA檢測(cè)其培養(yǎng)上清中表達(dá)的sTNF-α低于檢測(cè)水平。
　　 二、穩(wěn)定表達(dá)T

5、NF-α及其突變體細(xì)胞模型的建立
　　 復(fù)蘇本室前期工作建立的表達(dá)TNF-α及其突變體基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞克隆，收集高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染MG63細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選建立了表達(dá)TNF-α及其突變體基因的三種細(xì)胞模型。用各種方法鑒定證實(shí)TNF-α及其突變體基因在MG63細(xì)胞中得到有效表達(dá)。FCM結(jié)果顯示：MG63/wTNF細(xì)胞表達(dá)TNF-α量達(dá)29.97%；MG63/mTNF細(xì)胞表達(dá)TNF-α的量高達(dá)70.84%；然而MG63

6、/sTNF細(xì)胞表面也有少量的TNF-α的表達(dá)（9.15%），可能是由于細(xì)胞表面的TNFR結(jié)合了部分培養(yǎng)上清中的sTNF-α所致。ELISA檢測(cè)證實(shí)MG63/wTNF細(xì)胞和MG63/sTNF細(xì)胞的培養(yǎng)上清中sTNF-α的含量很高，分別為437.16pg/ml、380.95pg/ml；而MG63/mTNF細(xì)胞的培養(yǎng)上清中sTNF-α的表達(dá)量低于檢測(cè)水平。免疫熒光結(jié)果顯示MG63/sTNF細(xì)胞表面有微弱的熒光，呈環(huán)狀分布；而MG63/wTNF

7、細(xì)胞和MG63/mTNF細(xì)胞可見(jiàn)有很強(qiáng)的綠色熒光。Western blotting檢測(cè)的結(jié)果表明：MG63/wTNF細(xì)胞可見(jiàn)有26kD的mTNF-α和17kD的sTNF-α，但sTNF-α的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于mTNF-α，僅見(jiàn)微弱的條帶；MG63/mTNF細(xì)胞僅見(jiàn)明顯的26kD的mTNF-α的表達(dá)；MG63/sTNF細(xì)胞僅見(jiàn)微弱的26kD mTNF-α，但其培養(yǎng)上清中可見(jiàn)有明顯的17kD sTNF-α的表達(dá)。上述結(jié)果均提示這三種細(xì)胞模型建立成功

8、。
　　 三、TNF-α及其突變體的生物活性
　　 采用TNF-α敏感細(xì)胞株L929鑒定TNF-α及其突變體的生物學(xué)活性。將三種細(xì)胞株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取相同細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)24～48h，收集培養(yǎng)細(xì)胞和上清分別與靶細(xì)胞細(xì)胞共孵育，進(jìn)行TNF-α胞毒活性的檢測(cè)。結(jié)果顯示：固定的MG63/mTNF細(xì)胞具有胞毒活性（64.28%）；MG63/sTNF細(xì)胞的培養(yǎng)上清亦具有胞毒活性（30.65%）；MG63/wTNF細(xì)胞的固定細(xì)胞和培養(yǎng)

9、上清均有胞毒活性（37.79%、38.02%）。此外，細(xì)胞的胞毒效應(yīng)與其TNF-α的表達(dá)量呈正相關(guān)，并且胞毒效應(yīng)均能被TNF-α單抗所阻斷（p<0.01），提示其胞毒活性為T(mén)NF-α特異性的。
　　 四、細(xì)胞表達(dá)TNF-α基因的持久性檢測(cè)
　　 本研究的目的是建立穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞模型，故為了觀察細(xì)胞表達(dá)目的基因的持久性，采用了FCM定期測(cè)定連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞模型TNF-α表達(dá)量的改變。檢測(cè)結(jié)果顯示：在G418維持培養(yǎng)下

10、，細(xì)胞株經(jīng)過(guò)6次傳代培養(yǎng)約4周左右，TNF-α的表達(dá)量從86.23%下降至50%左右；而無(wú)G418維持培養(yǎng)的細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)約5次傳代培養(yǎng)約2.5周左右，TNF-α的表達(dá)量下降至50%。
　　 此外，由于細(xì)胞克隆在長(zhǎng)時(shí)間傳代培養(yǎng)后，目的基因的表達(dá)率明顯下降。為了維持較高表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆，將復(fù)蘇的細(xì)胞克?。‵CM檢測(cè)其TNF-α的表達(dá)率為21.29%）再次進(jìn)行亞克隆篩選，從而獲得了目的基因表達(dá)較高的亞克隆，F(xiàn)CM檢測(cè)其mTNF-