MT及其突變體αα基因在水花生中的整合與表達(dá).pdf

1、該實(shí)驗(yàn)室利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了含有兩個(gè)α結(jié)構(gòu)域的重組體蛋白α-KKS-α,并在體外證明了其對(duì)Cd 等重金屬的親和力強(qiáng)于天然MT蛋白.該工作利用植物基因工程的方法,使MT 及其αα蛋白在水花生中表達(dá),期望在體內(nèi)研究αα的生物學(xué)功能;并且利用MT 解毒重金屬的特性,提高水花生對(duì)Cd等重金屬的抗性和積累能力,從而開(kāi)發(fā)出新型植物用于環(huán)境重金屬污染的生態(tài)修復(fù).1.水花生組織培養(yǎng)的研究.以水花生為試材,將水花生的不同器官外植體接種在不同基本培養(yǎng)基

2、和添加不同激素種類及其濃度配比的培養(yǎng)基中培養(yǎng),研究外植體、培養(yǎng)基、外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響.水花生的莖段、葉、根作為外植體,以1/2 MS、B<,5>、MS(1/2)和MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的外源激素:BA 0.5~5.0 mg/L,ZT 0.5~4.0 mg/L,NAA 0~0.2 mg/L,IAA 0~0.5 mg/L.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,作為培養(yǎng)基1/2 MS比B<,5>、MS(1/2)和MS更適合愈傷組織的生長(zhǎng);莖、葉為適

3、宜組培的器官,并且莖段優(yōu)于葉;BA、ZT、NAA、IAA的各種組合均可啟動(dòng)外植體的脫分化過(guò)程,導(dǎo)致葉和莖段愈傷組織的產(chǎn)生和增殖,NAA不變,隨BA濃度上升,愈傷組織的誘導(dǎo)率上升.NAA/BA的比值越大越有利于根的分化.2.水花生遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.以水花生生長(zhǎng)點(diǎn)為材料,研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水花生生長(zhǎng)點(diǎn)的轉(zhuǎn)化體系.實(shí)驗(yàn)表明,4.0 mg/LPPT或150 μmol/L Cd<'2+>可以作為水花生生長(zhǎng)點(diǎn)芽分化的選擇壓,當(dāng)農(nóng)桿菌的濃度為OD<

4、,600>=0.2~0.4時(shí),農(nóng)桿菌浸染10 min左右,水花生生長(zhǎng)點(diǎn)PPT抗性芽的再生頻率最高,達(dá)到70％左右.通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),建立了水花生生長(zhǎng)點(diǎn)遺傳轉(zhuǎn)化體系.3.金屬硫蛋白MT及其αα基因在水花生中的整合與表達(dá).鑒定了含有MT及其αα基因的植物高效表達(dá)載體,凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHAl05,通過(guò)農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)浸染水花生生長(zhǎng)點(diǎn)的方法,將MT及αα基因?qū)胨ㄉ?在含有除草劑或鎘的培養(yǎng)基上篩選,

5、獲得抗性植株.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)點(diǎn)不需要經(jīng)過(guò)愈傷組織階段而直接從生長(zhǎng)點(diǎn)再生成芽,在不含有植物激素,附加4.0 mg/L PPT或150 gmol/L Cd<'2+>的1/2 MS培養(yǎng)基上再生頻率較高,但是生長(zhǎng)點(diǎn)的轉(zhuǎn)化頻率極低.在所有的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,共浸染了1364個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn),通過(guò)PCR和Dot blot印跡分析僅得到兩株轉(zhuǎn)基因植株,初步證明通過(guò)農(nóng)桿菌浸染水花生生長(zhǎng)點(diǎn)的方法可以使MT及其αα基因在水花生中進(jìn)行整合和表達(dá).比較對(duì)照、轉(zhuǎn)MT及其αα基因的植

6、株對(duì)重金屬Cd的抗性,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd的抗性高于對(duì)照.轉(zhuǎn)MT及其αα基因的植株在300 μmol/L Cd<'2+>中均能正常生長(zhǎng),而對(duì)照在300 gmol/L Cd<'2+>中生長(zhǎng)就受到了抑制.4.Cd<'2+>污染對(duì)水花生生理生化指標(biāo)的影響.通過(guò)設(shè)置不同Cd<'2+>污染濃度的水體,研究了Cd<'2+>污染對(duì)水花生(Alternanthera Philoxeroides(Mart.)Griseb.)生理生化指標(biāo)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯