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文檔簡介
1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文基于APRIL突變體的新型抗腫瘤分子的篩選與初步鑒定姓名:高全勝申請學位級別:博士專業(yè):病原生物學指導教師:黃復生20060501第三軍醫(yī)大學博士學位論文2 .構建了經H E L T h 表位修飾、缺失不同區(qū)域的s A P R I L c D N A 突變體( m s A P R I Lc D N A )借助P C R ,以p Q E .8 0 L /s A P R I L 為模板,分別克隆缺失不同區(qū)域的s A
2、P R I L e D N A突變體,通過核酸連接技術在相應缺失端加入H E L T h 表位。3 .構建了突變體原核表達載體將經H E L T h 表位修飾、缺失不同區(qū)域的s A P R I L c D N A 突變體分別克隆于原核表達載體p Q E .8 0 L ,測序證實序列正確。4 .制備了融合蛋白在大腸桿菌中誘導s A P R I L 及各融合蛋白表達,并借助W e s t e r n b l o t 鑒定表達產物。5 .純化
3、了蛋白產物表達產物經S D S .P A G E 檢測,主要以包涵體形式存在。用N i o N T A 柱純化包涵體溶解物,目的蛋白洗脫液經多步透析法復性后冷凍抽干,獲得一定量各種純化蛋白。6 .篩選出不具有s A P R I L 生物活性的突變體蛋白借助M T T 法證實:N 、C 端均連接H E LT h 表位的重組s A P R I L 突變融合蛋白,其在體外能刺激R a j i 細胞增殖;經H E LT h 表位修飾,N /C
4、端缺失4 5 b p ( 簡稱C 、D )或9 0 b p ( 簡稱E 、F ) 的s A P R I L 突變融合蛋白,其在體外不能刺激R a j i 細胞增殖。由此表明,已成功制備不具活性的s A P R I L 突變體C 、D 、E 和F ,且H E LT h 表位加入并不影響s A P R I L 活性。7 .探討了不具生物活性的突變融合蛋白誘導小鼠產生多克隆抗體的作用將C 、D 、E 和F 純化蛋白加佐劑后免疫小鼠,經E L
5、I S A 和W e s t e r n b l o t 鑒定,融合蛋白能刺激小鼠產生多克隆抗體,同時獲得抗C 、D 、E 和F 的抗血清。8 .探討了抗s A P R I L 突變體多抗對s A P R I L 生物活性的影響采用M T T 檢測發(fā)現(xiàn):抗C 、D 、E 和F 抗血清可分別抑制s A P R I L 促R a j i 和J u r k a t細胞增殖作用( 但抗F 抗血清對s A P R I L 促R a j i 細胞增
6、殖作用無影響) ,其中以抗D 抗血清抑制效果最強。9 .探討了突變體D 及其抗血清的生物學作用用突變體D 免疫無滲漏的S C I D 小鼠,采用E L I S A 和W e s t e r n b l o t 鑒定抗體產生,M T T 檢測該多克隆抗體對s A P R I L 促R a j i 和J u r k a t 細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn):成功獲得抗人s A P R I L 的多克隆交叉抗體;該多克隆抗體能抑制s A P R I
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