限飼對肉雞腓腸肌肌纖維與衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)與功能的影響及機(jī)理研究.pdf

1、本研究以內(nèi)雞為模型，研究不同生長階段限飼(1～14d和50～63d隔日限飼)對腓腸肌肌纖維肥大和類型轉(zhuǎn)化的即時和長期影響，以探討早期限飼可能的代謝程序化作用；通過檢測血清激素水平的變化，甲狀腺軸和生長軸相關(guān)基因，肌肉蛋白代謝與肌纖維類型相關(guān)基因，以及凋亡相關(guān)基因在腓腸肌的表達(dá)，進(jìn)一步分析限飼影響肌肉生長的可能機(jī)制；在此基礎(chǔ)上通過分離衛(wèi)星細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，深入探討早期限飼對衛(wèi)星細(xì)胞相對活力以及衛(wèi)星細(xì)胞相關(guān)功能基因表達(dá)的影響，通過在培養(yǎng)體

2、系中添加T3，觀察早期限飼以及限飼后恢復(fù)采食狀態(tài)下衛(wèi)星細(xì)胞對T3應(yīng)答反應(yīng)的差異，指出早期限飼可程序化地影響肌纖維肥大，并且這種影響主要由甲狀腺軸和生長軸相關(guān)基因介導(dǎo)，而主要作用靶細(xì)胞是衛(wèi)星細(xì)胞。 1、限飼對肉雞腓腸肌生長的影響 本實驗選取1d三黃雛雞，隨機(jī)分為自由采食對照組(Con)，1～14d隔日飼喂的早期限飼組(EFR)和50～63d隔日飼喂的后期限飼組(LFR)，分別于14、63d采集腓腸肌外側(cè)頭和血液樣品，檢測不

3、同階段限飼對內(nèi)雞整體和肌肉生長的影響.結(jié)果表明：1)早期限飼組體量及腓腸肌外側(cè)頭重持續(xù)低于對照組(除9w體重P<0.05、差異顯著外，其余均為P<0.01、差異極顯著)，后期限飼組63d腓腸肌重顯著低于對照組(P<0.05)，但體重與對照組沒有差異。2)早期限飼組14d血清T3、T4水平均顯著低于對照組(P<0.01)，63d血清T3水平仍顯著低于對照組(P<0.01)；后期限飼組63dT3、T4與對照組無差異.3)早期限飼主要降低了直

4、徑較粗的腓腸肌快肌纖維的橫截面積，且具有長期作用。后期限飼對所有肌纖維平均橫截面積沒有影響。4)14d早期限飼組慢肌及快紅肌肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(分別為P<0.01和P<0.05)，快白肌肌球蛋白重鏈基因表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)；63d早期限飼組慢肌肌球蛋白重鏈mRNA基因表達(dá)顯著低于對照組(P<0.01)，快紅肌和快白肌肌球蛋白重鏈與對照組相比均無差異(P>0.05)。5)ATPase染色法檢測到早期限

5、飼組14d慢肌纖維含量增加，63d慢肌纖維含量降低，快肌纖維含量增加.6)兩種方法檢測后期限飼組肌纖維類型均無變化。結(jié)果表明：1)早期限飼和后期限飼對肉雞腓腸肌生長影響截然不同，早期限飼的影響較為顯著并且持久，表現(xiàn)“程序化”作用；2)早期限飼阻礙了肉仔雞肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，抑制了肌纖維的肥大，延緩了肌肉的發(fā)育及增重，最終降低肉雞體重。3)甲狀腺激素可能參與早期限飼程序化作用的調(diào)節(jié)。 2、限飼影響肉雞腓腸肌生長的分子機(jī)理研究

6、 為了進(jìn)一步探索早期限飼對肌纖維生長程序化作用的可能機(jī)理，本實驗于14、63d采集垂體、肝臟及腓腸肌外側(cè)頭樣品(用于分子生物學(xué)鑒定)及腓腸肌組織樣，檢測不同階段限飼對生長軸和甲狀腺軸相關(guān)基因、涉及蛋白代謝和肌纖維類型轉(zhuǎn)化的相關(guān)候選基因(Calpain3，PGC-1，Calcineurin，NFAT)表達(dá)的影響，并對14d肌肉腓腸肌組織的細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行了對比.結(jié)果表明：1)與對照組相比，早期限飼組14d肝臟GHRmRNA表達(dá)下調(diào)(

7、P<0.05)，腓腸肌IGFR-ImRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，IGF-ImRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，63d肝臟TRa表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，腓腸肌GHR和IGFR-ImRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；后期限飼組除63d肝臟GHRmRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)外，其余基本沒有變化；腓腸肌TRa表達(dá)在各組間均無差異。2)早期限飼組PCNA蛋白陽性較強(qiáng)的肌纖維極顯著低于對照組(P<0.01)，腓腸肌中BaxmRNA表達(dá)及Bax

8、mRNA/Bcl-2mRNA均顯著高于對照組(P<0.05)，暗示早期限飼組凋亡增加。3)早期限飼、后期限飼不影響4種蛋白代謝和肌纖維類型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明：1)早期和后期限飼通過截然不同的機(jī)制影響內(nèi)分泌系統(tǒng)，早期限飼對肉雞的代謝程序化影響涉及到各級組織中內(nèi)分泌軸相關(guān)基因表達(dá)的改變。2)早期限飼抑制了14日齡肉雞腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖且可能促進(jìn)了整個肌肉組織中細(xì)胞的凋亡。2)限飼不影響腓腸肌中相關(guān)蛋白代謝和肌纖維類型轉(zhuǎn)化候選基因

9、的表達(dá)，提示肌纖維類型的變化可能是肌纖維肥大受阻的繼發(fā)作用。 3、早期限飼及恢復(fù)采食對腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖能力及內(nèi)分泌軸基因表達(dá)的影響 鑒于衛(wèi)星細(xì)胞增殖是肌纖維肥大的必要條件，本試驗選取1d三黃雛雞，隨機(jī)分為三組(對照組、14天隔日限飼組與12天隔日限飼2天恢復(fù)組)，于14d提取腓腸肌外側(cè)頭衛(wèi)星細(xì)胞，熒光半定量PCR法檢測其生長軸、甲狀腺軸及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，并通過體外培養(yǎng)添加不同濃度(3ng/mL、6ng/mL和生理濃

10、度12ng/mL)的T3觀測各組衛(wèi)星細(xì)胞的增殖狀況.結(jié)果表明：1)14天限飼組衛(wèi)星細(xì)胞IGF-ImRNA，表達(dá)顯著低于12天限飼2天恢復(fù)組(P<0.05)，極顯著低于對照組(P<0.01)，12天限飼2天恢復(fù)組表達(dá)低于對照組(P=0.06)；GHRmRNA表達(dá)對照組極顯著高于14天限飼組(P<0.01)、顯著高于12天限飼2天恢復(fù)組(P<0.05)，后兩組間沒有差異(P>0.05)；IGFR-ImRNA表達(dá)在14天限飼組、12天限飼2天

11、恢復(fù)組均顯著高于對照組(P<0.05)，但后兩組間沒有差異(P>0.05)。2)衛(wèi)星細(xì)胞TRamRNA表達(dá)在14天限飼組最高，與對照組差異顯著(P<0.05)、與12天限飼2天恢復(fù)組差異極顯著(P<0.01)，對照組與12天限飼2天恢復(fù)組間差異不顯著。3)Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)在3組間沒有差異，但BaxmRNA/Bcl-2mRNA14天限飼組最高、12天限飼2天恢復(fù)組最低，兩組間差異顯著(P<0.05)，但二組與對照組間均沒有差

12、異。4)體外培養(yǎng)MTT法測定衛(wèi)星細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致，3組衛(wèi)星細(xì)胞活力對照組最強(qiáng)，12天限飼2天恢復(fù)組其次，14天限飼組增殖能力非常弱。5)各濃度的T3處理對于14天限飼組衛(wèi)星細(xì)胞均無影響；對照組衛(wèi)星細(xì)胞在12ng/mLT3處理下細(xì)胞活力24、48h時極顯著高于空白對照組(P<0.01)，72h時與對照組無差異；12天限飼2天恢復(fù)組衛(wèi)星細(xì)胞在6ng/mLT3處理組48、72h時細(xì)胞活力均顯著高于空白對照組(P<0.01).結(jié)果表

13、明：1)早期限飼顯著降低了衛(wèi)星細(xì)胞的相對活力，限飼后恢復(fù)自由采食可抑制凋亡并部分恢復(fù)衛(wèi)星細(xì)胞的活力。2)內(nèi)分泌軸相關(guān)基因的表達(dá)與衛(wèi)星細(xì)胞活力相吻合，提示參與衛(wèi)星細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。3)T3處理3天后，低于正常生理水平的T3(6ng/mL)對限飼恢復(fù)后的衛(wèi)星細(xì)胞的活力有促進(jìn)作用，而正常生理水平的T3(12ng/mL)對于對照組(正常)的衛(wèi)星細(xì)胞的活力已經(jīng)沒有促進(jìn)作用，提示早期限飼改變衛(wèi)星細(xì)胞對T3反應(yīng)的時間和劑量依賴性，可能參與補(bǔ)償性生長的調(diào)