機(jī)械力對(duì)骶韌帶成纖維細(xì)胞形態(tài)及合成功能的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：女性盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是盆底支持組織因退化、損傷等導(dǎo)致肌肉韌帶松弛而引發(fā)的一類疾病。其病因?qū)W還不十分清楚，研究[1]多指向Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP、TIMP等細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)重塑引起組織力學(xué)性能的下降是該病的關(guān)鍵因素。所以本研究旨在：
　　 1、研究機(jī)械力對(duì)非POP患者骶韌帶成纖維細(xì)胞形態(tài)及整合素β1(integrinβ1)、Talin、Ⅰ、Ⅲ型膠原、基

2、質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 2、研究機(jī)械力與細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)系。
　　 3、探究機(jī)械力在女性盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象：選取2009年10月-2010年9月在河北醫(yī)大二院因非POP(惡性腫瘤除外)行子宮切除手術(shù)患者的骶韌帶15例，平

3、均年齡49.6±4.26歲，產(chǎn)次2.73±1.27次，體重指數(shù)24.75±2.44kg/m2。所有入選者均無(wú)結(jié)締組織疾病，術(shù)后病理證實(shí)為非子宮內(nèi)膜異位癥、非卵巢內(nèi)分泌性腫瘤等雌激素相關(guān)疾病，剔除急慢性盆腔炎和盆腔炎后遺癥的患者，剔除有該部位手術(shù)史者及近3個(gè)月內(nèi)有雌激素應(yīng)用史者。
　　 2、取材：經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者簽署知情同意書(shū)。所取標(biāo)本為骶韌帶近宮頸部分，筋膜外子宮全切時(shí)留取約5mm左右的骶韌帶組織，

4、4℃冷盒送實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)取材運(yùn)輸過(guò)程小于2小時(shí)。整個(gè)取材過(guò)程要求嚴(yán)格無(wú)菌。
　　 3、成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定：采用膠原酶消化法和組織塊法進(jìn)行骶韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 4、細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)：采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加載系統(tǒng)，選取15例3～4代指數(shù)生長(zhǎng)期的骶韌帶成纖維細(xì)胞通過(guò)flexcell-4000柔性基底加載系統(tǒng)加載、加力，加載

5、過(guò)程在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)樣本培養(yǎng)于特制的一次性六孔BioFlex培養(yǎng)板上，材質(zhì)為可變形的硅膠柔性膜，其上包被有collagenⅠ。加載程序由Flexcercell4000計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)控制。加載參數(shù)：幅度10％，正弦波，0.5Hz，加載時(shí)間分為0、4、15、24h，以不加力0小時(shí)為對(duì)照組，卸載后立即提取RNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量機(jī)械力對(duì)integrinβ1、talin、Ⅰ、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrixmet

6、alloproteinase-1，MMP-1)mRNA表達(dá)量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、所培養(yǎng)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，光鏡下細(xì)胞以梭形為主，也可見(jiàn)到不規(guī)則三角形、多角形等各種形狀的細(xì)胞，并彼此連接成網(wǎng)狀。免疫組織化學(xué)染色中間絲波形蛋白(vimentin)陽(yáng)性，細(xì)胞純度90.4％，平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色約8.3％陽(yáng)性率，角蛋白(cytokeratin)染色陰性。
　　 2、應(yīng)力作用后，細(xì)胞的形態(tài)和伸展方向

7、發(fā)生改變；拉伸前細(xì)胞形態(tài)多樣，梭形為主，也可見(jiàn)到不規(guī)則三角形、多角形等各種形狀的細(xì)胞，并彼此連接成網(wǎng)狀，向各個(gè)方向伸展；拉伸4h、15h、24h后細(xì)胞均為長(zhǎng)梭形，并垂直于最大應(yīng)變方向取向，以24小時(shí)最明顯。
　　 3、熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：應(yīng)力作用下，integrinβ1 mRNA4h、15h、24h表達(dá)量(18.822±0.500，32.527±2.559，40.357±2.140)較0h(1.008±0.059)顯著升高，

8、各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01；talin mRNA4h、15h、24h表達(dá)量(109.804±4.861，106.574±35.477，863.206±44.298)較0小時(shí)(1.009±0.468)顯著升高，4h、15h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01；Ⅰ型膠原mRNA4h、15h表達(dá)量(0.753±0.075，0.701±0.023)較0h(1.000±0.129)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義，p<0.01，加載力24hmRNA表達(dá)量(1.113±0.049)回升，與0h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05；Ⅲ型膠原mRNA4h、15h、24h表達(dá)量(4.792±0.036，6.146±0.594，5.021±0.594)較0h(1.000±0.249)顯著升高，24h與4h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01；MMP-1mRNA4h、15h、24h表達(dá)量(6.233±0.651，23.700±0.900，

10、20.133±0.751)較0h(1.000±0.100)升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1、一定范圍的機(jī)械應(yīng)力可以改變細(xì)胞的形態(tài)和伸展方向，并引起integrinβ1、talin mRNA合成的持續(xù)性增加，而Ⅰ型膠原mRNA合成先下降，但在加載力24h后，恢復(fù)至原來(lái)水平，Ⅲ型膠原、MMP-1 mRNA合成先增加，但在加載力24h后下降。
　　 2、盆底組織細(xì)胞外基質(zhì)重塑是對(duì)機(jī)械