盆底功能障礙性疾病患者與對照者骶韌帶成纖維細(xì)胞受力前后細(xì)胞骨架的變化.pdf

1、目的:
　　 1、了解盆底功能障礙性疾病患者(pelvicfloordysfunction,PFD)和對照者兩組骶韌帶成纖維細(xì)胞受力前后細(xì)胞骨架在形態(tài)和蛋白表達(dá)水平的差異。
　　 2、通過細(xì)胞骨架受力前后的變化研究細(xì)胞骨架和盆底功能障礙性疾病的關(guān)系。
　　 3、探討生物力學(xué)在盆底功能障礙性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:
　　 1、研究對象:選取2011年12月-2012年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第

2、二醫(yī)院婦科因PFD住院手術(shù)患者宮骶韌帶組織和同期患子宮良性疾病住院手術(shù)患者的宮骶韌帶組織各20例。PFD組患者平均年齡57.15±4.59歲,平均產(chǎn)次2.70±1.42次,所有PFD患者按照美國盆底器官脫垂定量分期法(pelvicorganprolapsequantitation,POP-Q)評分標(biāo)準(zhǔn)均符合子宮脫垂Ⅲ-Ⅳ度;對照組患者平均年齡54.60±3.89歲,平均產(chǎn)次2.60±1.39次,兩組患者年齡和產(chǎn)次差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有

3、入選者術(shù)后病理均證實(shí)為非子宮內(nèi)膜異位癥、非卵巢內(nèi)分泌性腫瘤等影響細(xì)胞骨架代謝的疾病,剔除結(jié)締組織性疾病、急慢性盆腔炎和盆腔炎后遺癥的患者,剔除有該部位手術(shù)史者及近3個月內(nèi)有雌激素應(yīng)用史者。經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會同意,所有患者簽署知情同意書。
　　 2、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:所取組織為子宮全切時標(biāo)本上殘留的骶韌帶,取材過程嚴(yán)格無菌,4℃冰盒送實(shí)驗(yàn)室,用組織塊法培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)成功后用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定,

4、確定為成纖維細(xì)胞。
　　 3、細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn):選取各組15例3～4代對數(shù)生長期的骶韌帶成纖維細(xì)胞通過flexcell-4000柔性基底加載系統(tǒng)加載、加力,加載過程在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)樣本培養(yǎng)于特制的一次性六孔BioFlex培養(yǎng)板上,材質(zhì)為可變形的硅膠柔性膜。加載程序由Flexcercell4000計(jì)算機(jī)軟件自動控制。加載參數(shù):幅度8％和20％,正弦波,0.5Hz,加載時間分別為0h、4h、12h、24h。
　　 4

5、、激光共聚焦和WesternBlot實(shí)驗(yàn):對加力前后細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架形態(tài)變化;提取總蛋白進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測β-actin、vimentin和filaminA的蛋白含量。所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、所培養(yǎng)組織塊于培養(yǎng)接種后的第8-10天有細(xì)胞從組織塊周圍游離出來,約30天左右細(xì)胞長滿整瓶

6、,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈長梭形或多角形,呈編織狀或旋渦狀排列。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示中間絲波形蛋白(vimentin)陽性,平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和角蛋白(cytokeratin)染色均為陰性,結(jié)合取材部位證實(shí)為骶韌帶成纖維細(xì)胞。
　　 2、加力前細(xì)胞呈不規(guī)則的多角形,排列方向不一,激光共聚焦顯微鏡下可見微絲熒光較強(qiáng),于胞漿內(nèi)散亂分布;加應(yīng)變率8％的力,隨加載時間的延長細(xì)胞逐漸被拉伸成長梭形,排列方向趨于一致,激光共聚焦顯微鏡

7、下細(xì)胞內(nèi)微絲聚集成較粗的應(yīng)力纖維,熒光亮度增強(qiáng);加載應(yīng)變率20％的力可見細(xì)胞輪廓模糊、崩解、脫落,激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞骨架解聚、斷裂,熒光減弱,應(yīng)力纖維崩解變細(xì)。
　　 3、加載8％的力各小時后β-actin蛋白含量較加力前均無明顯變化,Vimentin的蛋白含量與加力前比較有先下降后上升的趨勢,而filaminA的蛋白含量與加力前比較有升高的趨勢,PFD組β-actin和Vimentin的蛋白含量低于對照組,而filamin

8、A的含量PFD組高于對照組。加載20％的力后β-actin、Vimentin和filaminA較加力前蛋白含量均明顯下降,且加力相同時間下PFD組下降幅度比對照組更大。
　　 結(jié)論:
　　 1、生理范圍的力使細(xì)胞骨架發(fā)生解聚和重排、細(xì)胞形態(tài)和排列方向發(fā)生變化以適應(yīng)力的作用,較大的破壞性的力則使細(xì)胞骨架斷裂崩解、細(xì)胞凋亡脫落。
　　 2、PFD組骶韌帶成纖維細(xì)胞細(xì)胞骨架的含量較對照組低,PFD組在同樣大小力作用下較