成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞初步機(jī)理探討及對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用.pdf

1、目的：研究缺氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠發(fā)病過程中無肌性肺動(dòng)脈肌化的細(xì)胞來源，觀察缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及與無肌性動(dòng)脈肌化的關(guān)系，同時(shí)以人胚肺成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，研究缺氧和缺氧+TGF-β1對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞表型的影響。從而了解成肌纖維細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病(COPD)繼發(fā)缺氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的可能作用，為COPD肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制提供新的理

2、論依據(jù)。　　方法：動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)采用常壓低氧復(fù)制HPH大鼠模型(10％O2，每天間斷缺氧8小時(shí)，共21天)，在缺氧3天、7天、14天和21天不同時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組用右心導(dǎo)管法測定大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)，稱量法計(jì)算右心室肥大指數(shù)(RVHI)，HE染色進(jìn)行缺氧性肺小動(dòng)脈重塑(HPSR)觀察。透射電鏡觀察外膜成肌纖維細(xì)胞和腺泡內(nèi)血管壁細(xì)胞表型。原位雜交，免疫組化檢測HIF-1α、iNOS和TGF-β1在HPH進(jìn)展過程中的mRNA和蛋白

3、動(dòng)態(tài)變化及相互關(guān)系及其與mPAP，HPSR、RVHI的相關(guān)關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：人胚肺成纖維細(xì)胞(KMB17)復(fù)蘇后取3-4代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)計(jì)常氧組N(20％O2)；低氧組H(1％O2+5％CO2+平衡氮)；低氧+TGF-β1組H+T(1％O2+5％CO2+平衡氮，終濃度為5ng/mL)。免疫組化檢測α-SMA以確定KMB17是否發(fā)生表型轉(zhuǎn)化?！　〗Y(jié)果：缺氧7天起大鼠mPAP、管壁面積/管總面積(WA％)、管腔面積/管總

4、面積(LA％)分別為(18.41±0.37)mmHg、(52.2±0.8)％、(47.8±0.8)％與對(duì)照組(14.02±0.41)mmHg、(64.5±1.3)％、(35.5±1.3)％比較差異有顯著性(P＜0.05)，缺氧14天起穩(wěn)定于高水平；缺氧14天RVHI為(25.0±1.8)％與對(duì)照組(23.6±0.5)％比較差異也有顯著性(P＜0.05)。(2)從缺氧7天開始無肌型動(dòng)脈、部分肌型動(dòng)脈、肌型動(dòng)脈的構(gòu)成比分別是39％、46％、

5、15％與對(duì)照組60％、35％、5％比較差異有顯著性(Px2＜0.005)。(3)免疫組化發(fā)現(xiàn)，腺泡內(nèi)肺動(dòng)脈管壁α-SMA的表達(dá)隨著低氧時(shí)間的延長，α-SMA表達(dá)量逐漸增多。(4)透射電鏡觀察21天組增厚的重塑血管壁，位于內(nèi)外彈性膜之間的細(xì)胞為成肌纖維細(xì)胞表型，成肌纖維細(xì)胞含有特異性的微絲和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，外層具有與它緊密聯(lián)系的成纖維細(xì)胞。(5)HIF-1αmRNA對(duì)照組，缺氧3和7天組均不明顯，缺氧14天增高(0.203±0.02，P

6、＜0.05)，并維持于高水平；HIF-1α蛋白在對(duì)照組表達(dá)不明顯，各缺氧組肺血管內(nèi)膜均為陽性；在中膜，HIF-1α蛋白缺氧3天始增高(0.198±0.02，P＜0.05)，第7天達(dá)高峰(0.221±0.02，P＜0.05)，14天和21天下降。C組大鼠肺動(dòng)脈中膜iNOS蛋白弱陽性(0.109±0.021)，H3組增高(0.225±0.030，P＜0.01)，H7組(0.312±0.036)穩(wěn)定于高水平。C組大鼠肺動(dòng)脈壁iNOSmRNA弱

7、陽性(0.112±0.030)，H3組表達(dá)增強(qiáng)(0.245±0.036)，H7組達(dá)高峰(0.318±0.034，P＜0.01)并維持于高水平。TGF-β1蛋白在C組呈弱陽性(0.042±0.012)，H3組(0.198±0.031)表達(dá)增強(qiáng)，H7組達(dá)高峰(0.267±0.035，P＜0.01)，隨著缺氧時(shí)間延長，TGF-β1逐漸向基線水平回降；C組TGF-β1mRNA呈弱陽性表達(dá)(0.145±0.018)，H3、H7組表達(dá)增高不明顯(0

8、.163±0.021、0.176±0.026)，H14組增高(0.385±0.028，P＜0.01)，并維持于高水平，TGF-β1mRNA與TGF-β1蛋白于肺動(dòng)脈中膜和外膜表達(dá)。(6)細(xì)胞培養(yǎng)表明：缺氧能夠刺激成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，TGF-β1能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的發(fā)生。直線相關(guān)分析表明：HIF-1α、TGF-β1與iNOS均有相關(guān)性，且均與肺血管重塑指標(biāo)相關(guān)?！　〗Y(jié)論：　　1、TGF-β1能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維