黃芩苷對HCMV感染的HEL細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　1、測定黃芩苷的細(xì)胞毒性及抗HCMV半數(shù)有效濃度;
　　2、綜合探討黃芩苷對HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)凋亡的影響。
　　方法:
　　1、HCMV體外感染模型的建立:
　　采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)毒株HCMVAD169感染人成纖維細(xì)胞(HEL),根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)立高感染復(fù)數(shù)(MOI=2.5)和低感染復(fù)數(shù)(MOI=0.25)。
　　2、黃芩苷細(xì)胞毒性及抗HCMV病毒半數(shù)有效濃度測定:

2、　　用CCK-8法測定HEL細(xì)胞對黃芩苷藥物的最大耐受劑量(MTC);用標(biāo)準(zhǔn)空斑抑制法測定黃芩苷的抗HCMV半數(shù)有效濃度(EC50)。
　　3、HCMV感染細(xì)胞在不同感染時(shí)相的凋亡情況:
　　1)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比率:分別用高、低感染復(fù)數(shù)HCMV感染HEL細(xì)胞,分別于感染后24h、48h、72h和96h,采用Annexin-V/PI雙染法檢測凋亡細(xì)胞比率,同時(shí)設(shè)立模擬感染對照組。
　　2)Western-blot

3、法檢測凋亡關(guān)鍵蛋白pro-caspase-3表達(dá):予高感染復(fù)數(shù)HCMV感染HEL,分別于感染后36h、48h、60h、72h和84h收集細(xì)胞,采用Western-blot法測定pro-caspase-3蛋白表達(dá)量,設(shè)內(nèi)參蛋白β-actin,以校正值Κ進(jìn)行半定量檢測。
　　4、黃芩苷對HCMV感染細(xì)胞凋亡的影響:
　　根據(jù)HEL細(xì)胞對黃芩苷的最大耐受濃度20.6μg/ml,設(shè)置藥物劑量為:大劑量(20μg/ml),小劑量(10

4、μg/ml)。
　　1)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比率:實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)病毒感染量及黃芩苷劑量將實(shí)驗(yàn)分為9組:
　　①模擬感染組;
　?、谛┝奎S芩苷對照組;
　?、鄞髣┝奎S芩苷對照組;
　　④低感染復(fù)數(shù)組;
　?、莸透腥緩?fù)數(shù)+小劑量黃芩苷組;
　?、薜透腥緩?fù)數(shù)+大劑量黃芩苷組;
　?、吒吒腥緩?fù)數(shù)組;
　?、喔吒腥緩?fù)數(shù)+小劑量黃芩苷組;
　　⑨高感染復(fù)數(shù)+大劑量黃芩苷組。各組細(xì)胞分別

5、于感染病毒后24h,48h,72h,96h取樣,采用Annexin-V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比率。
　　2)Western-blot法:實(shí)驗(yàn)分組:
　?、倌M感染組;
　　②高感染復(fù)數(shù)組,
　?、鄹吒腥緩?fù)數(shù)+小劑量黃芩苷組;
　?、芨吒腥緩?fù)數(shù)+大劑量黃芩苷組。
　　四組細(xì)胞均于細(xì)胞凋亡發(fā)生最高峰,即感染后72h收集細(xì)胞,采用Western-blot法測定pro-caspase-3蛋白表達(dá)量

6、,設(shè)置內(nèi)參蛋白β-actin,以校正值Κ進(jìn)行半定量檢測。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立HCMV體外感染模型。
　　2、HEL細(xì)胞對黃芩苷的最大耐受濃度(MTC)為:20.6μg/ml。
　　3、黃芩苷抗HCMV的半數(shù)有效濃度為:16.13μg/ml。
　　4、HEL感染HCMV后不同時(shí)相凋亡情況:
　　1)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:模擬感染對照組細(xì)胞凋亡細(xì)胞比率維持在較低水平;低感染復(fù)數(shù)組,凋亡細(xì)胞比率隨感

7、染時(shí)間延長逐漸增加,96h達(dá)峰值為28.75％;高感染復(fù)數(shù)組,在感染早期隨感染時(shí)間延長,凋亡細(xì)胞比率也逐漸增加,72h達(dá)峰值(36.36%),96h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞比率下調(diào)(31.17%)。
　　2)Western-blot結(jié)果:HEL細(xì)胞感染高感染復(fù)數(shù)HCMV后pro-caspase-3隨感染時(shí)間延長表達(dá)量先增多后逐漸降低,于感染后72h達(dá)最低值。
　　5、黃芩苷對HCMV感染細(xì)胞凋亡的影響:
　　1)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

8、:大小劑量黃芩苷處理HEL細(xì)胞后凋亡細(xì)胞比率與模擬對照組相比未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高;大小劑量黃芩苷處理高低感染復(fù)數(shù)HCMV感染的細(xì)胞后,均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑凋亡效應(yīng),除大、小劑量黃芩苷處理的高感染復(fù)數(shù)組96h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞比率上調(diào)外,其余各組在黃芩苷處理后凋亡細(xì)胞比率均出現(xiàn)下降,表現(xiàn)為明顯的劑量依賴性。
　　2)Western-blot檢測結(jié)果:大劑量黃芩苷處理高感染復(fù)數(shù)HCMV感染細(xì)胞后pro-caspase-3表達(dá)量較未處理前增多