黃芩苷對沙眼衣原體GPAF的作用及影響.pdf

1、研究背景及目的:沙眼衣原體引起的感染性疾病在世界范圍內(nèi)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。黃芩苷作為一種天然的黃酮類化合物，對多種病原微生物都具有直接的殺滅作用，項(xiàng)目組前期工作已經(jīng)證實(shí)黃芩苷可以抑制體內(nèi)外模型中沙眼衣原體的生長，并能下調(diào)衣原體蛋白酶樣活性因子CPAF的表達(dá)。CPAF是由Ct858基因編碼，通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌至宿主胞漿的毒力蛋白。其蛋白水解酶活性作用于多種宿主靶細(xì)胞，從而在衣原體與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著重要作用。

2、本項(xiàng)目擬在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究黃芩苷對由CPAF裂解細(xì)胞內(nèi)靶蛋白引發(fā)關(guān)聯(lián)效應(yīng)的影響。我們認(rèn)為黃芩苷通過下調(diào)CPAF對靶蛋白的裂解水平，影響著細(xì)胞免疫逃逸、細(xì)胞骨架的溶解性和抗凋亡，干預(yù)Ct的持續(xù)性感染進(jìn)程。藉此項(xiàng)研究，我們試圖發(fā)現(xiàn)和建立一種干預(yù)Ct持續(xù)性感染進(jìn)程的新模式。這種新模式不僅使我們可更深入了解Ct感染的致病機(jī)理和豐富Ct持續(xù)性感染的基本理論，而且具有重要的治療學(xué)意義。本項(xiàng)目的具體研究目的如下:
　　1.圍繞黃芩

3、苷對由CPAF裂解靶蛋白引發(fā)關(guān)聯(lián)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)和建立一種干預(yù)Ct持續(xù)性感染進(jìn)程的新模式。
　　2.明確黃芩苷在干預(yù)Ct的體外感染過程中，CPAF所起的具體作用及其分子機(jī)制。
　　研究方法:1）Ct的細(xì)胞培養(yǎng)及黃芩苷的體外干預(yù):用HeLa229/PURL/McCoy細(xì)胞體外培養(yǎng)Ct，選取不同的時間點(diǎn)及不同濃度黃芩苷干預(yù)后(0.27Mm、0.54mM、1.08mM)，免疫熒光IF檢測衣原體包涵體數(shù)目及大小。2）對感染細(xì)胞免疫逃

4、逸功能的影響:Western blot檢測CPAF、RFX5及USF1蛋白表達(dá)水平;流式檢測細(xì)胞表面MHCⅠ、CD1d表達(dá)。3）對感染細(xì)胞抗凋亡的影響:Hoechst33258染色熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞凋亡率;AnnexinV/PI雙染流式檢測感染后不同時間段凋亡率;流式檢測活化的Caspase-3表達(dá)水平;Western blot檢測唯BH3域前凋亡蛋白Bim、Bik、Puma的蛋白表達(dá)水平。4）對感染細(xì)胞骨架溶解性的影響:鬼筆環(huán)肽ph

5、alloidine標(biāo)記F-actin，IF檢測細(xì)胞骨架重排效應(yīng);Western blot檢測CK8蛋白表達(dá)水平。5）體內(nèi)研究對Ct感染率的影響:構(gòu)建Ct經(jīng)生殖道感染小鼠模型，體外接種HeLa細(xì)胞，通過IF檢測感染率。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1）免疫熒光顯示黃芩苷顯著抑制衣原體體外生長，明顯縮小包涵體形成的大小及數(shù)目，分別用0.27mM、0.54mM、1.08mM濃度的黃芩苷予以體外干預(yù)，結(jié)果顯示隨著藥物濃度升高，其抑制作用越顯著。2）黃芩

6、苷下調(diào)衣原體CPAF表達(dá)，抑制感染細(xì)胞內(nèi)RFX5、USF1裂解，并進(jìn)而影響感染細(xì)胞表面MHCⅠ及CD1d下調(diào)。3）黃芩苷抑制感染宿主細(xì)胞唯BH3域前凋亡蛋白的降解，上調(diào)active-Caspase3的表達(dá)，有效抑制感染細(xì)胞的抗凋亡活性。4）黃芩苷抑制Ct感染導(dǎo)致的宿主細(xì)胞骨架重排及CK8降解。5）黃芩苷抑制Ct經(jīng)生殖道感染。
　　結(jié)論:1）黃芩苷顯著抑制衣原體的體外生長，并呈藥物劑量關(guān)系。2）黃芩苷阻礙衣原體感染引發(fā)的免疫逃逸效應(yīng)