γδT細(xì)胞在小鼠沙眼衣原體呼吸道感染中的保護(hù)作用及機制.pdf

1、衣原體(chlamydia)是一類嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，沙眼衣原體（Chlamydia trach omatis，Ct）是引起人類疾病的主要衣原體菌株，可引起沙眼、肺炎及性傳播疾病，通過性接觸傳播引起泌尿生殖系統(tǒng)炎癥，并可繼發(fā)不孕、不育等并發(fā)癥，對人類健康危害極大。由于對這一胞內(nèi)寄生菌誘導(dǎo)的復(fù)雜的宿主免疫反應(yīng)機制缺乏更全面、細(xì)致的了解，目前尚沒有有效的疫苗用于衣原體感染的預(yù)防。對衣原體感染宿主免疫保護(hù)機制的深入研究對有效預(yù)防和臨床治療衣原

2、體感染疾病有十分重要的意義。前期的研究已證實，αβT細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是CD3+CD4+T細(xì)胞分泌的IFNγ和IL-17在宿主抗衣原體感染中發(fā)揮重要保護(hù)作用。γδT細(xì)胞是參與先天性免疫應(yīng)答的細(xì)胞，活化后分泌IFN-γ、GM-CSF等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞功能，橋聯(lián)先天性和獲得性免疫。γδT細(xì)胞在感染早期能夠產(chǎn)生大量的IL-17A介導(dǎo)疾病的發(fā)生發(fā)展，這一功能日益受到關(guān)注。
　　目的：
　　利用沙眼衣原體小鼠肺炎菌

3、株（Cm）呼吸道感染模型探討γδT細(xì)胞在沙眼衣原體呼吸道感染中的增殖、活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生；利用γδT細(xì)胞基因敲除小鼠探討γδT細(xì)胞在沙眼衣原體呼吸道感染中的作用以及對衣原體特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　WT小鼠（C57BL/6鼠）鼻腔吸入1×103 IFU沙眼衣原體小鼠肺炎菌株（Cm），建立小鼠沙眼衣原體肺炎模型。為了確定γδT細(xì)胞的增殖、活化及細(xì)胞因子分泌，在Cm感染的不同時間點處死小鼠，分離小鼠脾及肺

4、組織單個核細(xì)胞，用熒光標(biāo)記的抗鼠CD3、TCRγδ及CD69抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測WT小鼠肺及脾組織CD3+TCRγδ+T細(xì)胞百分率及細(xì)胞數(shù)，確定Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的增殖；檢測CD3+TCRγδ+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)水平，確定Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的活化；利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測Cm感染不同時間點肺組織CD3+TCRγδ+T細(xì)胞細(xì)胞因子IFNγ和IL-17的分泌水平。為了進(jìn)一步確定γδT在衣原體肺炎中的作用，用上述方法分別

5、感染W(wǎng)T小鼠（C57BL/6）和TCRδ-/-小鼠（C57BL/6γδT KO鼠），每天監(jiān)測兩種小鼠體重變化；制備感染后不同時間點小鼠肺組織勻漿，體外感染Hep2細(xì)胞，用酶免疫法染色衣原體包涵體，計數(shù)包涵體形成單位（IFU）以確定感染小鼠肺組織衣原體繁殖水平；感染小鼠肺組織進(jìn)行H&E染色確定Cm感染誘導(dǎo)的肺組織炎癥。為了確定γδT細(xì)胞對宿主抗衣原體特異性免疫應(yīng)答的影響，用ELISA法測定脾臟單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ、IL-4及IL-

6、17的產(chǎn)生；進(jìn)一步采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)測定小鼠肺組織中CD3+CD4+T細(xì)胞IFNγ（Th1免疫應(yīng)答）、CD3+CD4+T細(xì)胞IL-4（Th2免疫應(yīng)答）及CD3+CD4+T細(xì)胞IL-17（Th17免疫應(yīng)答）水平，確定γδT細(xì)胞對宿主抗衣原體Th1、Th2、Th17免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　一定劑量的Cm經(jīng)呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠衣原體肺炎。與未感染的對照組（第0天）比較，Cm感染誘導(dǎo)小鼠肺及脾組織CD3+TCRγ

7、δ+T細(xì)胞百分率及肺組織γδT細(xì)胞總數(shù)逐漸升高，于感染后第7天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。肺組織CD3+TCRγδ+T細(xì)胞表面活化標(biāo)志分子CD69檢測結(jié)果顯示，與未感染組相比，CD69表達(dá)于感染后第3天達(dá)到高峰，此后略有降低。以上結(jié)果提示，Cm呼吸道感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞在感染部位及外周免疫器官聚集及活化。進(jìn)一步對γδT細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞分泌大量IFNγ、IL-17，與未感染對照組相比，Cm感染后第3天，

8、γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ、IL-17達(dá)到高峰，與αβT細(xì)胞分泌IL-17、IFNγ水平比較，γδT細(xì)胞主要在Cm感染早期（感染后前3天）分泌大量IFNγ和IL-17。我們用TCRδ-/-小鼠確定γδT細(xì)胞在Cm呼吸道感染中的作用。與WT小鼠比較，TCRδ-/-小鼠Cm感染后體重下降更為顯著，肺組織病理較重但兩組小鼠肺組織沙眼衣原體繁殖水平未見顯著差異，提示γδT細(xì)胞在Cm呼吸道感染中發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用。對γδT細(xì)胞抗衣原體感染免疫保護(hù)

9、機制進(jìn)行探討，WT與TCRδ-/-小鼠在Cm呼吸道感染后的第3天和第7天脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ、IL-4分泌無顯著差異但TCRδ-/-小鼠IL-17分泌顯著低于WT鼠，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色小鼠肺組織單個核細(xì)胞CD3+CD4+T IFNγ、CD3+CD4+T IL-4及CD3+CD4+T IL-17水平，結(jié)果顯示，TCRδ-/-小鼠在感染的第3天和第7天CD3+CD4+T細(xì)胞IL-17的產(chǎn)生顯著低于WT鼠，但CD3+CD4+T IFNγ和