產(chǎn)生大量IL-17的γδT細(xì)胞在沙眼衣原體感染中對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié).pdf

1、研究目的：
　　γδT細(xì)胞是參與宿主固有免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，是橋聯(lián)固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。有研究報(bào)道，IL-17+γδT能夠抑制調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的增殖及功能。本研究利用TCRδ-/-小鼠探討沙眼衣原體小鼠肺炎癥中產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞增殖的影響以及可能的作用機(jī)制，為γδT細(xì)胞與Treg細(xì)胞相互作用提供理論依據(jù)，也為固有免疫和適應(yīng)性免疫的相互調(diào)節(jié)增添新的內(nèi)容。
　　研究方法：
　　取6-8周齡雌性

2、WT(C57BL/6)和TCRδ-/-（C57BL/6遺傳背景）小鼠，經(jīng)鼻吸入1×103IFU沙眼衣原體小鼠肺炎菌株（Chlymydia muridarum，Cm），誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎。在感染的不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，收集肺泡灌洗液，制備肺組織單個(gè)核細(xì)胞懸液，用熒光素標(biāo)記的抗鼠CD3、γδT抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT的增殖；利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測(cè)肺組織CD3+γδT細(xì)胞及Vγ1和Vγ4γδT細(xì)胞亞群分泌IL-17水平；用EL

3、ISA方法檢測(cè)WT和TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量，探討Cm呼吸道感染誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞增殖及IL-17的產(chǎn)生。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) WT和 TCRδ-/-小鼠脾臟及肺組織 CD4+CD25+T及CD25+Foxp3+T細(xì)胞水平，確定沙眼衣原體呼吸道感染誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)探討WT和 TCRδ-/-小鼠肺組織Treg細(xì)胞相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)以及與Treg細(xì)胞活化及功能相關(guān)的細(xì)胞因

4、子IL-2、TGF-β和IL-10 mRNA表達(dá)水平改變，從而探討γδT細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞增殖的影響以及可能的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　經(jīng)鼻腔吸入一定劑量的Cm誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎及CD3+γδT+細(xì)胞在小鼠肺組織的增殖及產(chǎn)生大量IL-17。感染第1天CD3+γδT+細(xì)胞百分率即開(kāi)始增高（*P<0.05），于感染第7天達(dá)到高峰（***P<0.001），隨后降低，到感染第10天基本下降到未感染水平；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)

5、果顯示Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞在感染第一天既分泌大量的 IL-17（**P<0.01），至感染第三天達(dá)到高峰（***P<0.001），至感染后第五天γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17的水平已顯著降低（*P<0.05）。進(jìn)一步我們對(duì)小鼠肺組織存在的兩個(gè)重要的γδT細(xì)胞亞群 Vγ1和Vγ4 IL-17的分泌進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示 Cm感染小鼠肺組織 Vγ1基本不分泌IL-17，而Vγ4則分泌大量的IL-17，尤其是在感染第3天（***P<0.001）達(dá)

6、到分泌高峰，隨后迅速降低，至感染第10天降低至基礎(chǔ)水平，其變化趨勢(shì)與γδT細(xì)胞分泌IL-17一致。另外，我們的結(jié)果還證實(shí)，γδT細(xì)胞是感染早期IL-17的主要來(lái)源，TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液BAL中IL-17水平顯著低于WT小鼠（*P<0.05）。Cm感染能夠誘導(dǎo)小鼠外周免疫器官及局部炎癥部位Treg細(xì)胞增殖。與WT小鼠比較，TCRδ-/-小鼠脾組織Treg細(xì)胞百分率在感染后第3天顯著升高（**p<0.01），而感染第7天則顯著降低（

7、**p<0.01）；進(jìn)一步肺組織中Treg相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)趨勢(shì)與脾臟Treg細(xì)胞的變化一致（*P<0.05），提示在Cm感染的不同時(shí)間點(diǎn)，γδT細(xì)胞通過(guò)不同的途徑調(diào)節(jié) Treg細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步對(duì)其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染后第3天WT和TCRδ-/-小鼠肺組織Treg細(xì)胞活化因子IL-2 mRNA僅微量表達(dá)，而感染后第7天IL-2 mRNA在兩組小鼠肺組織明顯表達(dá)，且TCRδ-/-小鼠明顯低于WT小鼠（

8、**P<0.01）。肺組織Treg細(xì)胞功能性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10的PCR結(jié)果顯示，感染第3天TCRδ-/-小鼠IL-10水平明顯高于WT小鼠（*P<0.05），而感染第7天IL-10分泌明顯降低（*P<0.05），與Treg細(xì)胞增殖變化一致，而肺組織TGF-β mRNA表達(dá)在兩組小鼠未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　Cm呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠肺組織γδT細(xì)胞增殖并在感染早期分泌大量的IL-17，γδT細(xì)胞是感染早期IL-

9、17的主要來(lái)源，其中Vγ4是分泌IL-17的主要γδT細(xì)胞亞群。Cm感染能夠誘導(dǎo)小鼠外周免疫器官及局部炎癥部位Treg細(xì)胞增殖，在Cm呼吸道感染中存在著γδT細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，但在感染的不同階段調(diào)節(jié)機(jī)制不同，感染早期，γδT細(xì)胞可能通過(guò)分泌大量的 IL-17抑制 Treg細(xì)胞增殖，至感染中期IL-2的大量產(chǎn)生，可能是通過(guò)IL-2/IL-2R途徑促進(jìn)Treg細(xì)胞；在沙眼衣原體感染中，γδT細(xì)胞主要通過(guò)影響 Treg細(xì)胞功能性細(xì)