低劑量X線照射孕SD大鼠對子代神經(jīng)生長發(fā)育影響的研究.pdf

1、長期以來，圍繞低劑量電離輻射(Low doses of radiation，LDR)對人體是否有害、甚至是否有益一直存在著爭論，LDR對機(jī)體的影響一直是放射防護(hù)和生殖領(lǐng)域的的研究熱點。Luckey和Olivieri于80年代初提出低劑量輻射可誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生“興奮效應(yīng)”即Hormesis效應(yīng)(指在一定范圍內(nèi)的低劑量輻射可以對機(jī)體產(chǎn)生免疫刺激等效應(yīng))和“適應(yīng)性反應(yīng)”。以往對X射線的研究重點大多放在放射性損傷方面，對其促進(jìn)效應(yīng)的研究比較集中在

2、機(jī)體造血、免疫、抗腫瘤等方面，對于低劑量放射線引起后代生長發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)變化的研究報道多數(shù)將研究重點放在對機(jī)體的損傷方面，并且上述研究大多基于不同孕期單次給予大及較大放射線照射所產(chǎn)生的放射性損傷方面。目前國內(nèi)外關(guān)于孕期連續(xù)給予低劑量X線照射后對子代的體格及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育研究尚未見報道。本實驗建立受不同低劑量X線照射的孕SD大鼠模型，對其子代體格發(fā)育、機(jī)體的免疫功能進(jìn)行檢測，通過行為學(xué)檢測學(xué)習(xí)記憶能力及對大腦海馬區(qū)域與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行

3、病理學(xué)(HE染色及免疫組織化學(xué)染色)檢測，以期揭示孕期受不同低劑量X線照射對子代體格、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有無影響，有何影響，是否會促進(jìn)子代體格、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，并探索造成影響的可能相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步利用孕期受到LDR的影響提出新的理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.建立受不同低劑量x線照射的孕SD大鼠模型，并對其出生仔鼠一般神經(jīng)體格發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行檢測。
　　 2.觀察8周齡仔鼠外周血中CD3、CD4、CD8、CD4/C

4、D8、NK的變化，探討出生前受到不同低劑量x線照射與上述指標(biāo)的相關(guān)性及其與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的關(guān)系。
　　 3.通過Morris水迷宮系統(tǒng)對仔鼠(8周齡)的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行行為學(xué)檢測。
　　 4.通過HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并通過學(xué)習(xí)記憶相關(guān)免疫組織化學(xué)檢測指標(biāo)(谷氨酸受體NMDAR1、NMDAR2B、AMPAR/GluR1及MAPK/ERK1/2)對射線導(dǎo)致的子代行為學(xué)差異進(jìn)行解釋分析。
　

5、　 材料與方法:
　　 1.受孕SD大鼠模型的建立：12周齡清潔級健康成年雌性與雄性SD大鼠每晚7點1：1合籠，次日清晨7：00檢查雌鼠是否有陰栓，以陰栓法檢測是否受孕，并指定為孕第0d，并于第2d即孕第1d接受不同低劑量的X線照射。
　　 2.實驗分組：確定受孕SD大鼠25只，隨機(jī)分組，每組5只，分別接受0.015mGy/d(L1組)、0.03mGy/d(L2組)、0.06mGy/d(M組)、0.09mGy/d(H組

6、)劑量的X線照射及假照射(C組)，照射時間為18d，無間隔。仔鼠分組同孕鼠分組。
　　 3.照射條件：將孕SD大鼠于自然體位放在X射線發(fā)生儀球管下方，靶皮距為60cm，照射條件為：電壓50kV，電流90mAs，曝光時間200ms。
　　 4.一般神經(jīng)體格發(fā)育的檢測：仔鼠體重、體長變化的監(jiān)測。
　　 5.免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測：通過流式細(xì)胞儀檢測8周齡仔鼠外周血中CD3、CD4、CD8的含量及CD4/CD8比值的變化。

7、
　　 6.學(xué)習(xí)記憶檢測：通過Morris水迷宮系統(tǒng)檢測8周齡仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的差異。
　　 7.大腦海馬區(qū)HE染色觀察：行為學(xué)結(jié)束后，立刻取材。光鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并通過HE體視學(xué)形態(tài)定量分析軟件進(jìn)行錐體細(xì)胞層增生的寬度及錐體細(xì)胞密度變化的分析。
　　 8.免疫組織化學(xué)檢測：用Envision法對大鼠海馬CA1區(qū)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)指標(biāo)(谷氨酸受體NMDAR.1、NMDAR2B、AMPAR/

8、GluR1及MAPK/ERK1/2)檢測。
　　 9.統(tǒng)計學(xué)處理：采用Excel表及SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。各組計量資料數(shù)據(jù)以χ±S(mean±SEM)表示。
　　 結(jié)果:
　　 1.生長發(fā)育：L1組及L2組仔鼠體重、體長要高于對照組，P<0.01及P<0.05；M組與對照組相比較無明顯差異，P>0.05；H組仔鼠體重、體長要低于對照組，P<0.05。
　　 2.

9、免疫相關(guān)指標(biāo)變化：4個實驗組與對照組相比較外周血CD3、CD4、CD8的含量及CD4/CD8比值差別均無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。
　　 3.Morris水迷宮測試：
　　 3.1定位航行實驗4個實驗組與對照組隨著游泳訓(xùn)練天數(shù)的增加，每組大鼠逃避潛伏期時間均有不同程度的縮短，H組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長，M組大鼠逃避潛伏期與對照組相比較無明顯差異，L1組及L2組大鼠逃避潛伏期較對照組縮短。
　　 3.2空間

10、探索實驗H組大鼠原站臺象限停留時間明顯長于C組，并具有顯著差異，P<0.01；L1組與L2組在原站臺象限停留時間均短于C組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05、P<0.01；L1組與L2組之間無明顯差異，P>0.05；M組原站臺象限停留時間與C組相比較無明顯差異，P>0.05。穿越站臺次數(shù)：L2組穿越站臺次數(shù)要多于C組，P<0.05；L1組穿越站臺次數(shù)要多于C組，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05；M組穿越站臺次數(shù)要少于C組，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差

11、異，P>0.05；H組穿越站臺次數(shù)少于C組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。
　　 3.3搜索策略H組、M組與C組相比較無明顯差異，P>0.05；L1組、L2組主要以趨向式為主，與對照組相比較有顯著差異，P<0.01。
　　 4.大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果：C組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；M組、L1組及L2組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次增多，核增大，細(xì)胞排列整齊；H組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散、紊亂

12、。H組、M組、L1組及L2組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞增生的層次寬度寬于C組，與C組相比較具有顯著差異，P<0.01。但是H組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞增生的層次寬度不均勻，其余各組錐體細(xì)胞層次寬度均勻。H組單位面積錐體細(xì)胞密度低于其它各組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05；C組、M組、L1及L2組之間無明顯差異，P>0.05。
　　 5.與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)指標(biāo)免疫組化結(jié)果：大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸受體NMDAR1、NMDAR2B、AMPAR/Gl

13、uR1及MAPK/ERK1/2表達(dá)變化。
　　 L1組、L2組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞ERK1/2陽性細(xì)胞平均光密度值高于C組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05；C組與H組、M組相比較，無明顯差異，P>0.05；M組、H組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞ERK1/2陽性細(xì)胞平均光密度值低于Ll組及L2組，并具有顯著差異，P<0.01。
　　 H組大鼠海馬CA1區(qū)NR2B陽性細(xì)胞平均光密度值低于C組、M組、L1組及L2組，與C組、M

14、組相比較，P<0.05，與L1組及L2組相比較，并具有顯著差異，P<0.01；L1組及L2組海馬CA1區(qū)NR2B陽性細(xì)胞平均光密度值高于C組、M組。
　　 L1組、L2組大鼠海馬CA1區(qū)NRl陽性細(xì)胞平均光密度值高于C組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，分別為P<0.01及P<0.05；C組與M組及H組相比較無明顯差異，P>0.05；H組大鼠海馬CA1區(qū)NR1陽性細(xì)胞平均光密度值明顯低于L1組及L2組，并具有顯著差異，P<0.01。
　

15、　 大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞GluR1陽性細(xì)胞平均光密度：H組陽性細(xì)胞平均光密度值明顯高于C組、M組、L1組及L2組，并具有顯著差異，P<0.01；C組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞陽性細(xì)胞平均光密度值明顯低于H組、M組、L1組及L2組，并具有顯著差異，P<0.01。
　　 結(jié)論:
　　 1.出生前受到0.015mGy/d及0.03mGy/d劑量的X線照射對子代大鼠的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用；0.06mGy/d的X線照射對子代大

16、鼠的生長發(fā)育無明顯影響；0.09mGy/d的X線照射對子代大鼠的生長發(fā)育呈現(xiàn)出抑制作用。
　　 2.出生前受到4個低劑量X線照射后子代大鼠外周血中CD4、CD8、NK的含量和CD4/CD8的比值無明顯變化，提示本實驗所采用的X線劑量并未對胎鼠的免疫系統(tǒng)造成損傷或者仔鼠生長發(fā)育過程中受損的免疫功能得到了修復(fù)。
　　 3.出生前受到0.015mGy/d及0.03mGy/d的X線照射對子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有不同程度的促進(jìn)作用

17、，0.09mGy/d的X線照射損害了子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，0.06mGy/d的X線照射對子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力并未呈現(xiàn)出明顯的作用，由此推測孕期受一定低劑量X線照射對子代學(xué)習(xí)記憶能力的影響可以表現(xiàn)為三種效應(yīng)：正向效應(yīng)(促進(jìn)作用)、負(fù)向效應(yīng)(損傷作用)及零效應(yīng)(無明顯影響)。我們提出新的劑量一效應(yīng)曲線，不同于大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為的線性非閾模型。
　　 4.HE染色可以得出如下結(jié)論：出生前受到低劑量X線照射，促進(jìn)了大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)

18、胞的分化、增殖，當(dāng)照射劑量達(dá)到0.09mGy/d時，錐體細(xì)胞排列松散、稀疏，提示此劑量下神經(jīng)元出現(xiàn)了增殖過度，壞死、凋亡的表現(xiàn)。
　　 5.聯(lián)合行為學(xué)差異與免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，我們認(rèn)為出生前受0.015mGy/d及0.03mGy/d的X線照射促進(jìn)了子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的提高，表現(xiàn)為大鼠海馬CA1區(qū)NR1、NR2B、ERK1/2及GIuRl蛋白表達(dá)的增加；同時ERK1/2蛋白表達(dá)的增加促進(jìn)了錐體細(xì)胞的分化、增殖，并與學(xué)習(xí)記憶能力