一種新的干眼病模型—高滲鹽水點眼小鼠干眼病模型的建立與評估.pdf

1、背景與目的：
　　 干眼病(dry eye disease)又稱角結(jié)膜干燥癥(keratoconjunctivitis sicca)或者淚液功能不全綜合征(dysfunctional tear syndrome),是指任何原因引起的淚液質(zhì)和量的異?；騽恿W異常,導致淚膜穩(wěn)定性下降,并伴有眼部不適,導致眼表組織病變?yōu)樘卣鞯募膊】偡Q,是最常見的眼表疾病。干眼病嚴重影響患者的生活質(zhì)量。
　　 干眼病發(fā)病機制復雜,多種因素均可以

2、導致干眼病。美國眼科研究所干眼病研究小組將干眼病分為淚液生成不足型(包括Sj(o)gren's綜合癥和非Sj(o)gren's綜合癥淚液分泌不足)和淚液蒸發(fā)過強型。目前雖然有許多種干眼病模型,但是至今尚無一種動物模型可以準確模仿出該病頻繁發(fā)生,逐漸惡化,機制復雜的特點。雖然干眼病誘發(fā)因素眾多,機制復雜,但是該病發(fā)生的共同最終通路是淚膜不穩(wěn)定,淚液中電解質(zhì)濃度升高導致淚液滲透壓升高。淚液的高滲透壓是干眼病發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素。
　　

3、 研究表明,正常人淚液滲透壓是302±9.7mOsm/L,干眼病患者淚液的滲透壓是326.9±22.1mOsm/L。用316mOsrn/L作為干眼病的診斷指標,其總體準確度優(yōu)于其它任何一項干眼病診斷指標。
　　 本研究通過用高滲鹽水給小鼠點眼,提高淚液的滲透壓,制作淚液高滲透壓性干眼病模型,觀察是否可以引起和干眼病類似的體征和組織病理學損害,初步探討淚液高滲透壓在干眼病發(fā)病中的作用。
　　 方法
　　 1.動物

4、的選擇與分組6～8周齡雌性BALB/c小鼠60只,用隨機數(shù)字表法分為空白組(20只)、對照組(20只)、實驗組(20只),雙眼取用。對照組采用308mOsm/L氯化鈉溶液點眼,每天5次,實驗組采用500 mOsm/L氯化鈉溶液點眼,每天5次,空白組不點眼。
　　 2.SchirmerⅠ實驗在裂隙燈顯微鏡下,用顯微鑷夾住酚紅棉線,置于BALB/c小鼠眼睛的外眥部,60秒后取出,測量酚紅棉線濕潤的長度。
　　 3.角膜熒光素

5、染色和評分使用微量加液器在BALB/c小鼠下方結(jié)膜囊內(nèi)滴入1μl5％熒光素鈉溶液,3分鐘后在裂隙燈顯微鏡下采用鈷藍光檢查并照相記錄和評分。
　　 4.角膜虎紅染色使用生理鹽水浸濕的虎紅試紙,將浸濕的部分輕輕接觸BALB/c小鼠的角膜。在裂隙燈顯微鏡下照相和記錄。
　　 5.淚液蕨類實驗用毛細玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部淚液,涂在潔凈的玻片上,室溫干燥,48小時內(nèi)在光學顯微鏡下進行蕨類結(jié)晶圖像分析,并照相記錄。

6、>　　 6.角膜上皮和結(jié)膜上皮的組織學觀察采用HE染色在光鏡下觀察角膜上皮形態(tài),用圖像分析軟件測量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部結(jié)膜,采用PAS染色在光鏡下觀察上方穹窿部結(jié)膜上皮的形態(tài)。計算每個高倍視野下結(jié)膜杯狀細胞的數(shù)量。
　　 7.掃描電子顯微鏡觀察在第42天,用掃描電子顯微鏡觀察角膜上皮的形態(tài)。
　　 8.統(tǒng)計學方法采用Kruskal-Wallis H檢驗比較同一時間點三組BALB/c小鼠的角膜熒光素染色評分。采

7、用Wilcoxon秩和檢驗比較同一組不同時間點角膜熒光素染色評分。采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析比較同一時間點三組的角膜上皮厚度、淚液分泌量、結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量。采用t檢驗比較同一組不同時間點的角膜上皮厚度,淚液分泌量,結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量。
　　 結(jié)果
　　 1.SchirmerⅠ實驗第0天,空白組、對照組、實驗組的酚紅棉線浸濕長度未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。從第7天開始,實驗組酚紅棉線浸濕長度和第0天比較明顯減少(P＜

8、0.01)。第7天酚紅棉線浸濕長度較第0天下降了28％,第42天較第0天下降66％。
　　 2.角膜熒光素染色和評分第0天,空白組、實驗組、對照組均有BALB/c小鼠角膜少許點狀著色,角膜評分各組未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。實驗組BALB/c小鼠隨著實驗的進行,角膜中央點狀著色增加,逐漸出現(xiàn)片狀著色,病變累及角膜各個象限,以角膜中央為重。從第7天起,實驗組角膜熒光素染色評分和第0天相比明顯升高(P＜0.01)。實驗組第7天角

9、膜熒光素染色評分較第0天升高了75％。
　　 3.角膜虎紅染色第0天,空白組、實驗組、對照組均有3只BALB/c小鼠角膜虎紅染色可見少量點狀著色。實驗組BALB/c小鼠從第7天開始,角膜點狀著色逐漸增加,并且出現(xiàn)片狀著色,累計角膜4個象限,以中央和鼻側(cè)角膜為重。
　　 4.淚液蕨類實驗在各個檢查時間點,取空白組、對照組、實驗組BALB/c小鼠淚液,在光學顯微鏡下進行淚液蕨類結(jié)晶圖像分析?？瞻捉M、對照組在各個檢查時間點均可

10、觀察到形態(tài)良好的蕨類物形成。實驗組BALB/c小鼠淚液結(jié)晶中的蕨類物從第7天開始逐漸減少,蕨類物之間的連接中斷。第28天以后顯微鏡下僅能觀察到稀少的小蕨類物,甚至完全消失。
　　 5.角膜上皮HE染色的光鏡觀察和角膜上皮厚度測量空白組和對照組BALB/c小鼠角膜HE染色光鏡觀察可見上皮分層良好,分4～5層,基底部細胞排列呈柱狀,靠近角膜表面逐漸變成鱗狀上皮細胞。實驗組BALB/c小鼠隨實驗進展基底層細胞部分缺失,上皮細胞分層紊亂

11、,細胞層數(shù)減少,出現(xiàn)空泡。第0天和第7天,空白組、對照組、實驗組BALB/c小鼠的角膜上皮層厚度未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。從第14天起,實驗組較對照組和空白組角膜上皮層厚度明顯減少(P＜0.05)。
　　 6.結(jié)膜上皮PAS染色光鏡觀察和杯狀細胞計數(shù)空白組和對照組BALB/c小鼠的結(jié)膜上皮細胞排列整齊,杯狀細胞形態(tài)完整,分布在上皮細胞間,主要分布在穹隆部。實驗組BALB/c小鼠隨實驗進展,上皮細胞排列紊亂,甚至出現(xiàn)缺失,杯

12、狀細胞形態(tài)不一致,數(shù)量減少。在第42天部分BALB/c小鼠上方穹隆部杯狀細胞完全缺失。
　　 7.掃描電子顯微鏡觀察在第42天,用掃描電子顯微鏡觀察空白組、對照組、實驗組BALB/c小鼠角膜上皮細胞?？梢娍瞻捉M和對照組上皮細胞形態(tài)呈多邊形,細胞間緊密連接,細胞表面滿布微絨毛。實驗組BALB/c小鼠角膜表面微絨毛丟失,角膜表層上皮細胞破壞。
　　 結(jié)論
　　 1.用高滲鹽水給BALB/c小鼠點眼可以在小鼠角膜和結(jié)膜