JNK-AQP5在高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞干眼模型中的作用.pdf

1、目的：
　　探討AQP5的表達(dá)和.JNK的磷酸化在高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞干眼模型中的作用，為干眼病的抗炎治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先檢測(cè)不同程度高滲透壓(450 mOsm、500 mOsm、550 mOsm)刺激后用real-time PCR檢測(cè)HCECs中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和凋亡因子caspase-1，及AQP5的mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)，Western-blot檢

2、測(cè)AQP5和p-JNK的蛋白水平表達(dá)變化趨勢(shì)，并選擇出最佳的高滲透壓進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過加入20μM JNK抑制劑SP600125預(yù)處理2h的HCECs后，再給予500 mOsm高滲透壓刺激，同時(shí)設(shè)310 mOsm等滲組（Control組）和500 mOsm高滲+二甲基亞楓(DMSO)為對(duì)照組，用real-time PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、caspase-1和AQP5的mRNA基因表達(dá)變化，Western-b

3、lot檢測(cè)JNK磷酸化水平和AQP5的蛋白表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)AQP5的蛋白表達(dá)變化及TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況變化。并通過設(shè)計(jì)合成靶向人AQP5的干擾RNA，并將其轉(zhuǎn)染至HCECs，再給予500 mOsm高滲透壓刺激，同時(shí)設(shè)310 mOsm等滲組（Control組）和500 mOsm高滲+陰性轉(zhuǎn)染(siNC)為對(duì)照組，用同樣的方法檢測(cè)上述炎癥因子、凋亡水平及AQP5的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.不同程度高滲透壓

4、的選擇
　　Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于310 mOsm等滲對(duì)照組，450 mOsm高滲濃度組的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和凋亡因子caspase-l，及AQP5的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高均不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);500 mOsm和550 mOsm高滲濃度組的上述因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且以500 mOsm最為顯著。同時(shí)，W

5、estern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與310 mOsm等滲對(duì)照組相比，500 mOsm高滲透壓組的HCECs中AQP5(p=0.001)和p-JNK(p=0.003)的蛋白表達(dá)水平也有顯著性的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以，我們選擇500 mOsm為本細(xì)胞株是較佳的實(shí)驗(yàn)刺激滲透壓。
　　2.加入JNK抑制劑SP600125預(yù)處理后，高滲刺激下人角膜上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)、p-JNK和AQP5表達(dá)及凋亡情況變化
　　Real-t

6、ime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:給予20μM JNK抑制劑SP600125預(yù)處理2h的HCECs中JNK的磷酸化水平被抑制，對(duì)500 mOsm高滲刺激反應(yīng)明顯減弱，相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組炎癥因子IL-1β(p=0.003)、IL-6(p＜0.001)、IL-8(p=0.011)、TNF-α(p=0.007)和凋亡因子caspase-1(p=0.009)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500

7、 mOsm高滲+二甲基亞砜(DMSO)組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組炎癥因子IL-1β(p=0.006)、IL-6(p=0.007)、IL-8(p=0.011)、TNF-α(p=0.009)和凋亡因子caspase-1(p=0.012)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot法檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組AQP5的蛋白表達(dá)量(p＜0.001)和JNK的磷酸化

8、水平(p=0.012)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組AQP5的蛋白表達(dá)量(p=0.008)和JNK的磷酸化水平(p=0.001)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組AQP5的蛋白表達(dá)量明顯升高;相對(duì)于500 mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組AQP5的蛋白表達(dá)量明顯降低

9、。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組(p＜0.001) TUNEL法染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500 mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組(p=0.015)染色陽(yáng)性細(xì)胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.高滲刺激下轉(zhuǎn)染siAQP5的人角膜上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和凋亡情況變化
　　成功轉(zhuǎn)染siAQP5干擾RNA后的HCECs中AQP5基

10、因和蛋白表達(dá)均被明顯抑制，對(duì)500 mOsm高滲刺激無明顯反應(yīng)。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組(p=0.007) AQP5的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500 mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉(zhuǎn)染組(p=0.010) AQP5的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot法檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Cont

11、rol組，500 mOsm高滲組(p=0.002) AQP5的蛋白表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉(zhuǎn)染組(p=0.016) AQP5的蛋白表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組炎癥因子IL-1β(p＜0.001)、IL-6(p=0.004)、IL-8(p=0.001)、TNF-α

12、(p＜0.001)和凋亡因子caspase-1(p=0.004)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500 mOsm高滲+陰性轉(zhuǎn)染(siNC)組，500 mOsm高滲+siAQP5轉(zhuǎn)染組炎癥因子IL-1β(p＜0.001)、IL-6(p=0.005)、IL-8(p=0.002)、TNF-α(p＜0.001)和凋亡因子caspase-1(p=0.005)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUNE

13、L法檢測(cè)結(jié)果顯示:相對(duì)于Control組，500 mOsm高滲組(p＜0.001) TUNEL法染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相對(duì)于500 mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉(zhuǎn)染組(p＜0.001)染色陽(yáng)性細(xì)胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.高滲刺激下的人角膜上皮細(xì)胞干眼模型，JNK的磷酸化和AQP5的表達(dá)均明顯升高，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和凋亡因子也升高，促進(jìn)細(xì)胞的