山葡萄果皮cDNA文庫構(gòu)建及相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、山葡萄漿果含有前花色苷、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，是具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹資源。本試驗(yàn)以山葡萄果皮為材料，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)色前果皮cDNA文庫;并利用RACE方法克隆了CHS和CHI基因cDNA全長序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)山葡萄果皮成熟的7個(gè)時(shí)期的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　以山葡萄轉(zhuǎn)色前果皮為試驗(yàn)材料，采用In-Fusion(@)SMARTer(@)DirectionalcDNA Li

2、brary Construction技術(shù)構(gòu)建了cDNA文庫，經(jīng)鑒定，文庫初始滴度及擴(kuò)增后滴度分別為1.15×106pfu.mL-1和2.86×109 pfu.mL-1，插入片段長度約為0.5-2.0kb，平均0.9kb，重組率高達(dá)100％。這些結(jié)果說明，本試驗(yàn)在山葡萄轉(zhuǎn)色前果皮中成功構(gòu)建了cDNA文庫。為今后山葡萄功能基因分離克隆和功能基因組學(xué)研究建立了基礎(chǔ)。
　　通過RT-PCR結(jié)合快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)方法，獲得到了

3、CHS和CHI基因的全長cDNA序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因都具有完整的開放閱讀框，其中，CHS基因的cDNA全長1461bp，含有一個(gè)1182bp的開放閱讀框(ORF)，編碼393個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì);CHI基因的cDNA全長955bp，含有一個(gè)705bp的ORF，編碼234個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。共有的特性是:均為穩(wěn)定蛋白質(zhì)、整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性、不含跨膜結(jié)構(gòu)域、編碼的蛋白不具有信號(hào)肽、分子發(fā)育樹分析表明，均與歐亞種葡萄

4、同源性最高。
　　以山葡萄成熟過程中的7個(gè)時(shí)期漿果果皮為試驗(yàn)材料，ACTIN為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了CHS和CHI基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，在7個(gè)時(shí)期中均有表達(dá)，除了轉(zhuǎn)色前和10％轉(zhuǎn)色時(shí)期二者的表達(dá)量相近之外，其它5個(gè)時(shí)期中，CHS基因的表達(dá)量均明顯高于CHI基因。且CHS基因在七個(gè)時(shí)期中表達(dá)具有明顯的規(guī)律性，從轉(zhuǎn)色前至100％成熟期表達(dá)量呈依次增加的趨勢(shì)，完熟期表達(dá)量下降。而CHI基因的表達(dá)量沒有明顯的規(guī)律