棉花恢復(fù)系幼蕾cDNA文庫(kù)構(gòu)建及發(fā)育相關(guān)基因的克隆.pdf

1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,如何高效地利用棉花雜種優(yōu)勢(shì)成為當(dāng)今世界棉花育種關(guān)注的焦點(diǎn)之一,三系是培育棉花雜交種、利用雜種優(yōu)勢(shì)非常有效的途徑,能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益.但是由于恢復(fù)系資源狹窄,強(qiáng)優(yōu)勢(shì)三系組合較少,如果能夠通過(guò)基因克隆技術(shù)得到使棉花具有恢復(fù)能力的相關(guān)基因,進(jìn)一步獲得工程恢復(fù)系,對(duì)擴(kuò)大恢復(fù)系資源、擴(kuò)大三系雜交種的應(yīng)用具有非常重要的意義. 本研究以高產(chǎn)抗蟲(chóng)三系朵交棉恢復(fù)系為材料,該恢復(fù)系聚合了來(lái)源于哈克尼西棉的恢

2、復(fù)基因和來(lái)源于陸地棉的恢復(fù)加強(qiáng)基因,構(gòu)建其幼蕾cDNA文庫(kù),并篩選可育系和不育系差異表達(dá)基因,獲得如下結(jié)果: 1.以棉花恢復(fù)系3～5天幼蕾為材料,改進(jìn)熱硼酸/蛋白酶K法沉淀RNA 8MLiCl的用量,選用Trizol法和改進(jìn)的熱硼酸/蛋白酶K法提取總RNA,通過(guò)比較表明熱硼酸/蛋白酶K法是提取棉花幼蕾RNA的適宜方法,該法提取的棉花幼蕾總RNA完整性較好,純度較高,RNA外觀沒(méi)有任何顏色,棉酚褐化現(xiàn)象得到很好的抑制.

3、 2. 從棉花恢復(fù)系幼蕾總RNA中純化出mRNA,構(gòu)建棉花恢復(fù)系幼蕾cDNA文庫(kù),最終獲得的未擴(kuò)增文庫(kù)約含克隆子1.6×10<'6>,重組率約為92﹪,平均插入片段大小為1.9kb;對(duì)文庫(kù)擴(kuò)增后,獲得的文庫(kù)滴度為 7.7×10<'9>pfu/ml,可滿足基因表達(dá)和克隆研究的要求. 3. 根據(jù)三系雜種F<,2>中可育系和不育系抑制差減獲得的大小為380bp的差異EST,在其兩端設(shè)計(jì)引物,初步篩選棉花恢復(fù)系幼蕾cDNA文庫(kù),獲得了

4、1個(gè)陽(yáng)性克隆.對(duì)該陽(yáng)性克隆子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn): (1) 該基因外源插入片段長(zhǎng)為1462bp.用NCBI中EST同源序列比較分析發(fā)現(xiàn),該片段序列與陸地棉纖維SSH文庫(kù)中得到的cDNA片段同源性達(dá)到98﹪.與雜交稻中得到的cDNA片段同源性達(dá)到99﹪.在開(kāi)花期一天的纖維中、三周的陸地棉組織及擬南芥中得到的cDNA片段都有很高的同源性.但是這些cDNA片段的功能均未驗(yàn)證. (2) 該基因序列中135～1343區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)完整的