中華卵索線蟲(chóng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及Sox-3基因部分片段的克隆.pdf

1、中華卵索線蟲(chóng)(Ovomermis sinensis)屬于線蟲(chóng)綱Nematouda毛管超目Trichosyfingida索目Mermithida索科Mermithidae六索線蟲(chóng)亞科Hexamermithinae卵索線蟲(chóng)屬Ovomermis，是一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。該線蟲(chóng)營(yíng)寄生生活，寄主廣泛，寄生率幾乎等于害蟲(chóng)的死亡率，具有很大生物防治潛力?，F(xiàn)階段人們常采用噴灑化學(xué)農(nóng)藥的方法來(lái)防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，但同時(shí)也間接地殺害了田間的中華卵索線蟲(chóng)，導(dǎo)致其數(shù)量銳

2、減并面臨滅絕的危險(xiǎn)，且目前實(shí)現(xiàn)其大量體外培養(yǎng)的條件尚未成熟。本研究的目的在于通過(guò)構(gòu)建中華卵索線蟲(chóng)cDNA文庫(kù)來(lái)保存該物種基因資源，便于相關(guān)功能基因的篩選和研究。cDNA文庫(kù)是以特定組織或細(xì)胞的mRNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，經(jīng)載體連接且轉(zhuǎn)化受體菌后形成重組DNA克隆群。所構(gòu)成的文庫(kù)包含該組織或細(xì)胞的全部mRNA信息，反映其特定階段基因的表達(dá)情況。cDNA文庫(kù)較基因組文庫(kù)小，便于特異基因的篩選，自1976年首次成功構(gòu)建cD

3、NA文庫(kù)以來(lái)，相繼出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化cDNA、染色體區(qū)域特異性cDNA文庫(kù)、消減cDNA文庫(kù)、酵母雙雜交cDNA文庫(kù)、SMART cDNA文庫(kù)等構(gòu)建方法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，文庫(kù)構(gòu)建的方法越來(lái)越簡(jiǎn)便，文庫(kù)的質(zhì)量也越來(lái)越高。
　　 本實(shí)驗(yàn)使用Trizol試劑從各發(fā)育期中華卵索線蟲(chóng)提取總RNA，以其作為反轉(zhuǎn)錄模板，通過(guò)Clontech公司購(gòu)買(mǎi)的CreatorTM SMARTTM試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)，與T載體連接后電轉(zhuǎn)大腸桿菌，涂布在含相應(yīng)

4、抗生素的LB固體平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第二天收集菌落，且滴度測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)滴度為1.16×109cfu/ml，包含克隆數(shù)為6.0×106，重組率接近100％。符合cDNA文庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，可用于后續(xù)基因的篩選和功能研究。
　　 Sox基因家族保守性較高，普遍表達(dá)于鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、爬行類(lèi)等動(dòng)物中，通過(guò)對(duì)其功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因在性別決定與分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、早期胚胎的發(fā)育、軟骨和組織器官的形成中起重要作用。Sox基因