中華卵索線蟲tra-1基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、中華卵索線蟲(Ovomermis sinensis)是一種昆蟲病原線蟲，其性別分化決定于寄生期的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力(環(huán)境決定型)，目前有關(guān)此類線蟲性別決定及分化的分子機(jī)制還不清楚。 為了探明中華卵索線蟲性別決定及分化的機(jī)制，在參考國(guó)內(nèi)外其它線蟲等相關(guān)研究文獻(xiàn)資料基礎(chǔ)上，首次從該線蟲中克隆到了性別決定基因tra-1 cDNA片段，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其在中華卵索線蟲發(fā)育各期中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。 主要的研究結(jié)果如下：

2、 (1)利用RT-PCR和3'RACE技術(shù)從中華卵索線蟲中克隆了tra-1 基因3’端cDNA部分序列。該序列總長(zhǎng)度為800bp，編碼一個(gè)包含195個(gè)氨基酸殘基的多肽，用SMART軟件對(duì)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該多肽含有3個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指；同源性分析表明，本實(shí)驗(yàn)所獲得的中華卵索線蟲tra-1基因氨基酸序列與人的GL13、果蠅CiD結(jié)構(gòu)域、C.elegans TRA-1A、C.briggase TRA-1A及Ppa-T

3、RA-1在鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域具有較高的同源性，相似性分別為：70％、71％、73％、77％、71％，而在此區(qū)域外相似性僅為6％。從而說明中華卵索線蟲tra-1基因編碼的蛋白質(zhì)亦屬于GLI轉(zhuǎn)錄因子家族，且僅在鋅指區(qū)域具有很高的保守性。 (2)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了tra-1基因在中華卵索線蟲胚胎、感染期幼蟲、A組(感染比例為1：40)寄生1、2、3、4、5、6天幼線蟲、B組(感染比例為1：10)寄生1、2、3、4、5、6天幼線蟲、

4、寄生后期雌幼線蟲、寄生后期雄幼線蟲、蛻皮后雌成蟲、蛻皮后雄成蟲和懷卵雌蟲中的表達(dá)。結(jié)果顯示，蛻皮后雌成蟲tra-1相對(duì)表達(dá)量最高，且與其它時(shí)期的差異極其顯著(P<0.01)；到懷卵雌蟲與受精卵中tra-1相對(duì)表達(dá)量顯著下降，但仍顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；其它實(shí)驗(yàn)組包括感染期幼蟲、寄生各期幼蟲(寄生1、2、3、4、5、6天)、寄生后期雌雄蟲及雄成蟲之間表達(dá)無明顯差異(P>0.05)．結(jié)合形態(tài)學(xué)研究結(jié)果比較分析表明，在性腺分化的關(guān)

5、鍵時(shí)期，tra-1基因的高水平表達(dá)促使性腺分化為雌性生殖腺，低水平表達(dá)促使其分化為雄性生殖腺，即在中華卵索線蟲，TRA-1A參與調(diào)控生殖腺的發(fā)育與分化；由定量結(jié)果，推測(cè)TRA-1A參與調(diào)控該線蟲卵的形成和胚胎發(fā)育。 以上研究得出，IRA-1A在中華卵索線蟲中的功能與其在其它自由生活的線蟲中的功能是一致的，從而說明TRA-1A在功能上具有一定的保守性。通過以上對(duì)中華卵索線蟲tra-1 cDNA序列及表達(dá)模式研究表明，tra-1基因