無芒隱子草（Cleistogenes songorica）種質(zhì)抗旱評價、cDNA文庫構建及相關基因克隆與鑒定.pdf

1、野生植物攜帶有潛在的特異基因和變異基因，通過功能基因組的研究和基因挖掘，可揭示此類植物適應環(huán)境脅迫的特異機制，為農(nóng)作物和草類植物的基因改良奠定基礎。無芒隱子草(Cleistogenes songorica）為旱生性多年生草類，其極端抗旱性及作為沙漠草原恢復重建種的潛在價值已逐漸得到認可。本研究從收集我國極抗旱野生無芒隱子草種質(zhì)資源、分析種質(zhì)抗旱特性基礎上，構建其干旱脅迫誘導cDNA文庫；通過高通量測序技術平臺獲得大量cDNA序列；通過高

2、性能生物信息學平臺挖掘無芒隱子草抗旱功能基因組信息，進行抗旱相關基因的表達產(chǎn)物分析、轉基因模式植物(擬南芥)的功能驗證，確定目標基因的功能，為這些基因在草類作物遺傳改良中的利用奠定基礎。主要結論如下。 收集到我國16份野生無芒隱子草種質(zhì)資源，采用RAPD標記分析了無芒隱子草種群遺傳多樣性。用篩選得到的7個隨機引物，共擴增出52條DNA片段，其中23條為多態(tài)性片段。分子變異分析(AMOVA)結果顯示，種群間的變異占總變異的53.1

3、9％，種群內(nèi)不同個體間的變異占總變異的46.81％，種群間的變異存在著顯著性差異(P<0.001)。聚類分析將無芒隱子草16個種群大致劃分為3個聚類組：第一個聚類組包括10個種群，即：pop1～pop5、pop7、pop13～pop16：第2個聚類組包括pop6、pop8、pop11和pop12；第3個聚類組包括pop9和pop10。 以無芒隱子草遺傳差異較大的三個種群CS01，CS09和CS15為材料，通過觀察其幼苗體內(nèi)水分、

4、光合作用參數(shù)、葉綠素熒光參數(shù)和光合色素等特征，研究其在持續(xù)干旱及復水期間忍耐極端干旱的保護機制。證實這三個種群響應干旱脅迫能力存在差異。干旱脅迫過程中，無芒隱子草仍保持相對較高的葉片相對含水量(75％)和葉水勢(-3.2MPa)，屬于高水勢耐旱型植物；光合器官和光合色素含量在干旱脅迫下受到嚴重影響；而光化學器官的功能影響不大，除PSⅡ最大光化學效率Fv/Fm略有下降外，其它光化學參數(shù)都變化不大。無芒隱子草在持續(xù)缺水的環(huán)境下，光合速率持續(xù)

5、下降，而胞間CO2濃度變化卻不明顯，兩者變化方向不一致，故初步判斷無芒隱子草凈光合速率下降歸因于葉肉細胞同化能力的降低。 采用SMART技術，構建了無芒隱子草的輕度干旱脅迫根和葉、極度干旱脅迫根和葉共4個cDNA文庫，文庫Cs01L、Cs02R、Cs03L和Cs04R的重組率分別為78.6％、100％、78.6％和71.4/％，插入片段大小在0.2～2.8kb之間。采用5’端隨機測序的策略對無芒隱子草不同材料來源的全長cDNA文

6、庫進行了測序，共獲得5664條序列。去除載體和污染序列，并將50bp以下序列剔除后共計獲得3579條高質(zhì)量序列，總序列長度達到2，191，166bp，平均每個EST長度為613bp。把獲得的高質(zhì)量EST使用phrap進行組裝和去冗余后獲得1499個重疊群，包括805個獨立非冗余序列和694個多成員非冗余序列?；蚬δ茏⑨?GO)采用與UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的匹配，60％(899條)無芒隱子草序列得到GO功能注釋術語。這些GO術語中包

7、含分子功能、生物過程、細胞組分三個層次，分別占22％、46％和32％。功能注釋顯示脅迫響應基因63個，其中與抗旱密切相關的基因25個。使用國際上通用的SSR引物設計軟件，對1499個無芒隱子草EST(長度共計1.03Mb)進行了SSR分子標記的鑒定，共找到161個SSR特異分子標記。 采用RACE法等相關技術進一步克隆無芒隱子草22個抗旱相關基因全長序列，已經(jīng)獲得全長序列10個。geNorm程序獲得無芒隱子草7個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)

8、定度由高到低依次為：CsEIF5_2>CsEIF5_1>CsGAPDH>CsActin-11>CsUBQ>CsTUA2>CsHistone，以表達相對最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因GAPDH、CsEIF5_1、CsEIF5_2獲得定量PCR實驗中相對定量或絕對定量數(shù)據(jù)的所有標準化因子，以標準化因子對全部數(shù)據(jù)進行標準化。通過RT-PCR、qPCR相對定量來鑒定無隱子芒草22個抗旱相關基因的表達，發(fā)現(xiàn)有8個基因的表達是由干旱脅迫誘導的，并且受干旱脅迫

9、的差異調(diào)控較顯著，在脅迫過的根和葉中的表達都較對照增加3倍以上；qPCR絕對定量進一步研究7個基因在不同組織、不同脅迫處理(干旱脅迫0天、4天、6天、8天、10天、以及恢復澆水后l天和4天共7個關鍵時間點)的表達情況，揭示了這些基因在適應干旱環(huán)境過程中的表達調(diào)控機制。 CsALDH基因在干旱脅迫下根系中相對表達量是對照的17倍。相對定量和絕對定量結果顯示CsLEA2基因只在脅迫誘導下才表達，此基因在脅迫4天后的根中低水平表達，脅