菊花花器官cDNA文庫的構(gòu)建及DgGA20ox基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、菊花原產(chǎn)我國，是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。但菊花新基因的發(fā)掘和分子育種方始起步，本研究在構(gòu)建菊花花器官EST文庫，分析其花序開放過程基因表達(dá)譜基礎(chǔ)上，對(duì)GA20-氧化酶基因新基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析。主要結(jié)果如下：
　　 1.首次以菊花特定發(fā)育階段的花器官為植物材料，利用pBluescript XR載體構(gòu)建了一個(gè)菊花花器官cDNA文庫，文庫滴度為1.8×107

2、pfu/ml，擴(kuò)增后文庫滴度達(dá)9.O×1011pfu/ml。經(jīng)過藍(lán)白斑計(jì)數(shù)，文庫的重組率可達(dá)90％。平均插入片段大小為1-2kb左右，說明所構(gòu)建的文庫完全符合目的基因分離篩選和表達(dá)建庫的要求。通過4個(gè)花器官優(yōu)勢表達(dá)基因的半定量PCR分析，均發(fā)現(xiàn)在花器官中的表達(dá)量較高，說明該文庫具有代表性和有效性，可為進(jìn)一步開展與菊花發(fā)育相關(guān)基因的克隆及花器官發(fā)育分子機(jī)理的探討等研究奠定重要的基礎(chǔ)。
　　 2.在構(gòu)建的cDNA文庫中隨機(jī)挑選了7,

3、500個(gè)克隆進(jìn)行5’端測序，共獲得7,307條原始序列。原始序列經(jīng)去除插入片段小于100bp和污染序列后，共得到6,924條高質(zhì)量的EST序列，平均GC含量為43.5％，序列遞交DDBJ數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)：DK936567-DK943490);CAP3程序拼接ESTs得到4,563個(gè)Unigenes，其中包括996個(gè)contigs和3,567個(gè)singlets，冗余度為34.1％。通過序列比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)有57.2％的Unigenes(2,6

4、08)能夠通過注釋進(jìn)行功能分類，而42.8％的Unigenes(1,955)不能比對(duì)上現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的任何蛋白質(zhì)或核酸序列，推測1，955個(gè)Unigenes可能是有一些已知基因的非編碼區(qū)序列，也有可能是一些功能未知的新基因。
　　 3.所得到的EST序列中，編碼RuBP羧化酶小亞基的EST數(shù)量最多，說明rbcs基因在該cDNA文庫中的表達(dá)量較高。26.7％的Unigenes(1,217/4,563)可以通過COG聚類，其中最高14

5、.79％的Unigenes(180/1,217)編碼轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶，而與防衛(wèi)機(jī)制以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的Unigenes最少。在所有的6,924條高質(zhì)量ESTs序列中，35.1％能比對(duì)上擬南芥的ESTs,27.2％的序列比對(duì)上了水稻的ESTs序列，與菊科植物向日葵、萵苣、非洲菊、百日草的ESTs序列相比較，分別有82.0％、64.6％、48.8％和24.4％的序列能比對(duì)上。同時(shí)，在6,924條ESTs中，有131個(gè)ESTs編碼

6、推測的轉(zhuǎn)錄因子，占整個(gè)Unigenes的2.78％(131/4,563)。其中表達(dá)量最高的是C3H轉(zhuǎn)錄因子家族，占全部轉(zhuǎn)錄因子ESTs的16.0％(21/131)；在4,563個(gè)Unigenes中，我們找到了6個(gè)已知的花發(fā)育相關(guān)基因和10個(gè)與花色素合成代謝相關(guān)的基因。
　　 4.在菊花花器官cDNA文庫的EST序列中，找到一條與GA20-氧化酶基因同源的EST(克隆號(hào)：rfchcaa0_007176)。挑選該克隆進(jìn)行雙向測序，并

7、進(jìn)行3’、5’ RACE-PCR得到1,543bp的全長菊花GA20-氧化酶基因cDNA序列（DgGA20ox,AB360381），具有一個(gè)1,134bp的ORF，編碼377個(gè)氨基酸及103bp的5’非編碼區(qū)和306bp包含了多聚A尾的3’非編碼區(qū)。與其相應(yīng)的基因組DNA序列(1,468bp,AB360434)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因基因組DNA序列中包含了90bp和234bp的內(nèi)含子。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其具有GA20-氧化酶所特有的依

8、賴2-酮戊二酸的雙加氧酶特性的保守序列，如與2-酮戊二酸結(jié)合有關(guān)的保守序列NYYPXCQKP，與GA底物結(jié)合有關(guān)的LPWKET基元以及可能與Fe2+結(jié)合有關(guān)的His殘基（H246和H302）和Asp殘基(D248),并與同科植物萵苣的Ls20ox1氨基酸序列有87％的同源性，確定為菊花的GA20-氧化酶基因。Southern雜交表明，該基因在菊花中存在多個(gè)同源拷貝。
　　 5.熒光定量PCR結(jié)果表明，DgGA20ox基因在菊花的

9、嫩葉中表達(dá)量最高，其次是莖和花中，根中的表達(dá)量最少，說明嫩葉可能是菊花活性GA生物合成的主要位點(diǎn)；在菊花頂芽中，DgGA20ox基因在一天中的表達(dá)呈規(guī)律性起伏，在黑暗條件下的轉(zhuǎn)錄水平比在光照條件下高，且在光照結(jié)束后4h表達(dá)量最高。外源激素處理證明了DgGA20ox基因的表達(dá)受活性GA的反饋抑制調(diào)控，內(nèi)源GA含量高時(shí)，DgGA20ox基因的表達(dá)受抑制；內(nèi)源GA生物合成受阻抑時(shí)，DgGA20ox基因的表達(dá)量升高，同時(shí)內(nèi)源的IAA含量也升高，

10、說明IAA在GA的生物合成中有重要作用。
　　 6.構(gòu)建DgGA20ox基因正義表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過PCR和Southern雜交鑒定，有3個(gè)株系整合進(jìn)了外源DgGA20ox基因。表型觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照矮化，葉片小，生長勢弱；進(jìn)而進(jìn)行DgGA20ox基因的表達(dá)分析及內(nèi)源GA含量測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中無論是DgGA20ox基因的表達(dá)量還是內(nèi)源GA含量都明顯低于對(duì)照，推測轉(zhuǎn)基因植株可能出現(xiàn)了共抑制的