小尾寒羊cDNA文庫的構(gòu)建及RPL23A基因表達(dá)的研究.pdf

1、小尾寒羊是我國重要瀕危物種之一，構(gòu)建小尾寒羊的cDNA文庫對(duì)于小尾寒羊遺傳資源的保護(hù)具有重要意義。本研究運(yùn)用SMARTTM技術(shù)成功地構(gòu)建了小尾寒羊的cDNA文庫。以小尾寒羊耳緣組織為試驗(yàn)材料，用GENMED試劑盒提取總RNA，核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)其OD260/280值為1.98，甲醛變性電泳后出現(xiàn)兩條帶：28S和18S，其亮度約比為2:1。以提取的RNA作為模板，用LD-PCR法擴(kuò)增cDNA的第二條鏈，瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示一條彌散的帶，大小在

2、4Kb以下，用Sfi內(nèi)切酶切割ds-cDNA后，回收酶切的大片段，將其與λ噬菌體連接，然后用包裝蛋白進(jìn)行包裝、再擴(kuò)增，即得到小尾寒羊cDNA文庫。檢測(cè)小尾寒羊cDNA文庫的容量、重組率以及插入片段長(zhǎng)度。所構(gòu)建的cDNA文庫擴(kuò)增后文庫的滴度為1.5×1010pfu/mL，重組率為95.83％，插入片段平均大小為910bp。
　　 運(yùn)用PCR擴(kuò)增法，從小尾寒羊cDNA文庫中篩選了核糖體蛋白基因RPL23A，測(cè)序結(jié)果與Genbank進(jìn)

3、行比對(duì)，相似度達(dá)到96％。本試驗(yàn)采用了雙酶切法成功地構(gòu)建了RPL23A基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N3-RPL23A和原核表達(dá)載體pGEX--4T-1-RPL23A。SDS-PAGE和Westernblot檢測(cè)pGEX-4T-1-RPL23A融合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在42kD左右的位置出現(xiàn)RPL23A融合蛋白的表達(dá)帶，表明RPL23A基因在BL21菌中表達(dá)成功。
　　 試驗(yàn)中采用貼壁法培養(yǎng)了烏珠穆沁羊成纖維細(xì)胞，利用脂質(zhì)

4、體2000介導(dǎo)法將pEGFP-N3-RPL23A導(dǎo)入體外培養(yǎng)的烏珠穆沁羊成纖維細(xì)胞中。共聚焦顯微鏡觀察RPL23A基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，綠色融合蛋白在烏珠穆沁羊成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布。轉(zhuǎn)染后24h熒光在細(xì)胞中分布均勻，48h后細(xì)胞核中表達(dá)強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)并達(dá)到峰值，72h后熒光強(qiáng)度逐漸衰弱，細(xì)胞逐漸凋亡。重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率在9.7％～22.8％之間。
　　 綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建