Leptin在肝臟缺血-再灌注損傷中的變化規(guī)律及其重組、表達(dá).pdf

1、第一部分 目的：建立大鼠肝臟缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion，I/R)損傷模型，探討大鼠肝臟I/R損傷時(shí)血清Leptin蛋白及脂肪組織Leptin mRNA水平的變化規(guī)律，探討影響血清Leptin水平變化的因素，以及此變化規(guī)律對(duì)機(jī)體的影響。 方法：將45只體重220g左右的雄性sD大鼠隨機(jī)分為5組，第一組為假手術(shù)組(Sham組)，第二組為肝臟缺血60min、再灌注60min(160R60)組，第三組

2、為160R150組，第四組為160R240組，第五組為160R360組。麻醉后，在門(mén)靜脈分出發(fā)向肝臟尾葉的分支上，以動(dòng)脈夾夾閉肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管，建立大鼠肝臟70％I/R損傷模型。動(dòng)脈夾置入后，關(guān)閉腹腔。缺血60min后，取出動(dòng)脈夾進(jìn)行再灌注。采用高靈敏鼠Leptin放射免疫分析法測(cè)定血清Leptin濃度變化，并采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)脂肪組織Leptin mRNA表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：(1)與Sha

3、m組(12.01±2.73 ng/ml)才目比，160R60組(17.77±5.61 ng/ml)和160R150組(17.26±6.13 ng/ml)血清Leptin濃度即出現(xiàn)增高趨勢(shì)，I60R360組(19.54±6.04 ng/ml)血清Leptin濃度顯著增高(q=4.39，P<0.05)。(2)與Sham組相比，160R60組、160R150組扣160R240組Leptin mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變，160R360組Lept

4、in mRNA表達(dá)水平降低(輝度比值q=4.56， P<0.05)。 結(jié)論：大鼠70％肝臟缺血-再灌注損傷模型建立成功。Leptin作為一種炎性因子，參與了大鼠肝臟I/R損傷的病理生理改變過(guò)程。大鼠血清Leptin濃度在肝臟I/R損傷早期和中期呈升高趨勢(shì)，但脂肪組織Leptin nlRNA表達(dá)水平在損傷后期呈下降趨勢(shì)。 第二部分 目的：為了獲得重組人Leptin(rh-leptin)蛋白高表達(dá)的菌株及大量具有生物

5、活性的rh-leptin蛋白，構(gòu)建Leptin重組表達(dá)載體，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，對(duì)rh-leptin蛋白進(jìn)行復(fù)性及純化，并鑒定其免疫學(xué)及生物學(xué)活性。 方法：提取脂肪組織RNA，通過(guò)RT-PCR方法獲得用PCR方法擴(kuò)增人Leptin的編碼區(qū)，使產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體相連，轉(zhuǎn)染DH5 α。測(cè)序后，選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒擴(kuò)增。將酶切后的leptin片段與pET-28a(+)載體連接，獲得leptin的表達(dá)質(zhì)粒。將重

6、組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，測(cè)序結(jié)果顯示Leptin編碼區(qū)沒(méi)有突變產(chǎn)生，用IPTG誘導(dǎo)leptin重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western印跡雜交進(jìn)行免疫學(xué)分析。并通過(guò)Km小鼠減肥實(shí)驗(yàn)及胃腸推進(jìn)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其生物學(xué)活性。 結(jié)果：在包涵體蛋白22 kDa處有明顯的新增蛋白帶，其含量超過(guò)總蛋白的50％；經(jīng)Western-blot證實(shí)為重組的人leptin蛋白。大量表達(dá)后，經(jīng)蛋白復(fù)性和純化，通過(guò)Km小鼠減