PrxⅢ在大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)的表達變化.pdf

1、腎臟是機體內(nèi)重要的排泄與分泌器官，對維持機體酸堿平衡以及鉀、鈉、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定具有重要作用。因此，腎臟對維持機體整個內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)腎臟功能被損害時，其遠端或鄰近器官如肝、肺、心、腦和腸等的功能也會同時受損。
　　腎缺血再灌注損傷( Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是臨床上一種常見的病理生理反應(yīng)，常見于腎臟移植或急性腎動脈阻斷等臨床治療過程中。RIRI也是

2、導(dǎo)致腎移植病人術(shù)后功能恢復(fù)延遲，甚至發(fā)生急性腎衰增加患者死亡率的重要因素。在到達腎臟的血流被暫時性阻斷，隨后又恢復(fù)其血液供應(yīng)重新充氧的過程中，會有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)。這也是引發(fā)缺血再灌注損傷的重要機制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，可以與細胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)、DN

3、A和胞膜上的脂類等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng)，促進細胞凋亡和死亡，加劇腎臟組織損傷。
　　Peroxiredoxin（Prx）是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類能清除ROS的過氧化物酶系。Prx Ⅲ是Prx家族成員之一，也是整個家族中唯一的特異性定位于線粒體的酶蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：Prx Ⅲ產(chǎn)生于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后依靠定位信號定位于線粒體。線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要產(chǎn)生來源，同時它自身也是ROS的主要攻擊靶點。近些年的研究發(fā)現(xiàn)：Prx Ⅲ與細胞線粒體內(nèi)H

4、2O2的清除有密切關(guān)系。Prx Ⅲ可能是線粒體內(nèi)ROS的重要清除者。
　　心臟是機體內(nèi)需氧量大、對缺血缺氧反應(yīng)極為敏感的臟器之一。線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP是心肌細胞的主要能量來源。在此過程中會有大量電子從呼吸鏈泄露出來從而形成ROS。因此，心臟是機體內(nèi)最容易受到ROS攻擊遭受過氧化損傷的器官。在腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)時，心臟此時是否也會發(fā)生過氧化損傷，氧化應(yīng)激是否也是引起心肌損傷的主要機制之一？心肌組

5、織Prx Ⅲ的表達如何變化，是否參與此氧化應(yīng)激過程？未見報道。
　　本研究采用無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24小時后觀察心肌組織內(nèi)H2O2含量、MDA含量，以及抗氧化酶Prx Ⅲ基因水平和蛋白水平的表達變化，探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌組織損傷的氧化應(yīng)激機制，以及Prx Ⅲ在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用，為防治腎缺血再灌注引起的心肌組織損傷提供一條新思路。
　　目的：
　　觀察大鼠

6、腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織是否也處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，以及抗氧化酶Prx Ⅲ的基因水平和蛋白水平的表達變化，探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌損傷的氧化應(yīng)激機制，以及Prx Ⅲ在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　雄性Wister大鼠12只，體重200±10 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，隨機分為對照組（Control）和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI)，每組各

7、6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml／kg），參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動脈,在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見腎動脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎,分離左腎動脈,但不夾閉左腎動脈。24小時后收集血液，3000rp

8、m離心10min,分離血清用于肌酐（Serum Creatinine，SCr）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）濃度測定;處死大鼠取腎臟和心臟，將腎臟于4%多聚甲醛中固定進行HE染色,觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將心臟置于液氮中用于Prx Ⅲ mRNA和蛋白水平測定以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量測定。
　　2、測定指標(biāo)及方法
　　2.1、血清SCr和BUN水平測定

9、>　　血清SCr濃度采用苦味酸法測定；血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。
　　2.2、 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn) Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進行圖象分析。
　　2.3、大鼠心肌組織MDA含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液

10、，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％心肌組織勻漿，勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4、大鼠心肌組織H2O2含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μ

11、l加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％心肌組織勻漿。勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測定，以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。
　　2.5、大

12、鼠心肌組織Prx Ⅲ mRNA水平測定
　　用TRIzol法提取心肌總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對照，進行 RT-PCR。分別以 PrxIII的擴增產(chǎn)物與 GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對表達量
　　2.6、大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平測定
　　采用Western blot法測定大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化酶Prx Ⅲ的蛋白表達水平。將大鼠心肌組織制成勻漿,離心后取上清。采用改良Lowr

13、y法測定其蛋白總量.電泳的蛋白上樣量為62 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx Ⅲ抗體,室溫靜置過夜。經(jīng)洗膜后再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG二抗。經(jīng)雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見部分腎小球萎縮，體積變?。荒I小囊腔擴張；腎小管管腔明顯擴

14、張；腎間質(zhì)水腫，腎小管間隙擴大；集合管出現(xiàn)管腔擴張等改變。
　　2、血清SCr水平
　　Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L，而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組（P<0.05）。
　　3、血清BUN水平
　　Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L，而RIRI組血清BUN的

15、濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組（P<0.05）。
　　4、心肌組織勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的 MDA含量為10.18±1.77mmol/g，而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量為14.01±2.29 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組（P<0.01）。
　　5、大鼠心肌組織勻漿內(nèi)H2O2的含量<

16、br>　　Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的 H2O2含量為13.93±1.88 mmol/g，而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的H2O2含量為18.56±2.56 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的H2O2含量明顯高于Con組（P<0.01）。
　　6、大鼠心肌組織Prx Ⅲ mRNA的相對表達量
　　采用 RT-PCR的方法測定大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對表達量。Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對

17、表達量為0.95±0.17，RIRI組心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對表達量為1.34±0.18，RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA水平明顯高于Con組（P<0.01）。說明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)PrxIII的基因表達水平升高。
　　7、大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平
　　Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平為0.58±0.09，RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平為1.01±0.17。

18、RIRI組Prx Ⅲ蛋白水平明顯高于對照組（P<0.01）。說明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平升高。
　　結(jié)論：
　　1、切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。
　　2、腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌組織也處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，并引起心肌組織的過氧化損傷。
　　3、Prx Ⅲ的基因和蛋白表達水平在RIRI模型心肌組織內(nèi)均明顯增強。表明Prx Ⅲ可能參