鞘脂在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中脂類(lèi)組學(xué)變化及機(jī)制的初步研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，I/R injury),常見(jiàn)于許多臨床病理過(guò)程和肝臟手術(shù)過(guò)程，如失血性休克、肝移植手術(shù)、肝葉切除等。再灌注過(guò)程中Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化和氧自由基的產(chǎn)生等引起肝臟組織細(xì)胞發(fā)生了一系列代謝、結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死和凋亡。已經(jīng)有大量研究對(duì)肝臟缺血再灌注損傷中肝細(xì)胞死亡的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。但對(duì)其機(jī)制仍未完全明確，進(jìn)一步揭示肝臟缺

2、血再灌注中的分子機(jī)制仍是目前需要進(jìn)一步研究的重要課題。 系統(tǒng)生物學(xué)(systems biology)是一個(gè)嶄新的并且快速發(fā)展的研究領(lǐng)域。它通過(guò)對(duì)一個(gè)細(xì)胞或者一個(gè)生物體內(nèi)所有物質(zhì)分子定量的分析以及這些分子之間相互作用的研究，從而達(dá)到從系統(tǒng)水平對(duì)于整個(gè)生物體或細(xì)胞的生物反應(yīng)的理解。因此，它需要對(duì)所有生物物質(zhì)分子進(jìn)行高通量的鑒定技術(shù)，例如基因組學(xué)(genomics)和蛋白組學(xué)(proteomics)是分別對(duì)DNA/RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行高

3、通量的分析的方法。最近，一個(gè)新的概念“脂類(lèi)組學(xué)(lipidomics)”被提出，它主要是利用質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)對(duì)脂類(lèi)進(jìn)行高通量的分析。 近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)鞘脂(sphingolipids)及其代謝產(chǎn)物參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和死亡相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。其中神經(jīng)酰胺是公認(rèn)的在眾多誘導(dǎo)性刺激過(guò)程中起關(guān)鍵作用的第二信使，在多種肝臟疾病中介導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程，抑制肝癌的生長(zhǎng)。最近也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺參與了肝臟缺血再

4、灌注損傷。然而，由于既往的研究方法缺乏對(duì)鞘脂功能研究的足夠重視和在脂類(lèi)研究中方法學(xué)上的不足，目前尚沒(méi)有對(duì)鞘脂在肝臟疾病中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究。脂類(lèi)組學(xué)的出現(xiàn)使得對(duì)鞘脂進(jìn)行系統(tǒng)的分析成為可能。 材料與方法: 健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為2組：1)對(duì)照組(control group)，僅作剖腹游離肝鐮狀韌帶及肝十二指腸韌帶，左、中葉肝蒂不行阻斷，(2)缺血再灌注組(I/R組)，建立大鼠70％肝臟缺血再灌注

5、損傷模型，使左、中肝葉缺血缺血45分鐘后，開(kāi)放左、中葉血流實(shí)現(xiàn)再灌注。再灌注后分別與0.5、1、3、6、12小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死5只大鼠，經(jīng)心臟穿刺抽血離心后保存?zhèn)溲錋LT、AST含量測(cè)定，取肝左葉組織，經(jīng)行HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化；取左、中葉肝臟組織，稱(chēng)量濕重。采用經(jīng)典脂類(lèi)提取方法，提取了冰凍肝臟組織中的鞘脂并保存于-70℃。利用基質(zhì)輔助激光解離一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laser

6、desorption ionization-time of flight MS，MALDI-TOF-MS)分析了此模型中肝臟鞘脂全部種類(lèi)的代謝變化。選取了鞘脂類(lèi)代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)和酸性鞘磷脂酶(ASM)進(jìn)行RT-PCR分析。 結(jié)果: 1、再灌注后血清中ALT、AST值與對(duì)照組比較均有顯著升高(P＜0.05)。病理表現(xiàn)：對(duì)照組組織結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞無(wú)明顯變性壞死，亦無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；再灌注后

7、FR組各時(shí)點(diǎn)，肝組織結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞變性壞死明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量多，尤以6小時(shí)損傷最為嚴(yán)重。 2、質(zhì)譜結(jié)果顯示肝臟組織主要存在三類(lèi)鞘脂：神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺單己糖苷。再灌注后0.5小時(shí)幾類(lèi)鞘脂總量均無(wú)明顯改變。神經(jīng)酰胺在再灌注后1小時(shí)開(kāi)始增加(P＜0.05)；再灌注后3，6和12小時(shí)，神經(jīng)酰胺和鞘磷脂均明顯增加(P＜0.05)，并伴隨新的峰出現(xiàn)，尤其是在再灌注后6小時(shí)出現(xiàn)6種新的分子，分別是(m/z)537.8、583.

8、8、567.7、555.7和683.5、731.4。同時(shí)在6小時(shí)，還有多種鞘脂達(dá)到它們最高豐度，如：(m/z)657.4、701.6、723.5等。除神經(jīng)酰胺和鞘磷脂兩種主要的鞘脂外，我們還檢測(cè)到一種神經(jīng)酰胺單己糖苷CMH，(m/z)804.4，其豐度變化趨勢(shì)與神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的變化一致。總體來(lái)看，再灌注后鞘脂在總量上是持續(xù)增加的，在6小時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.01)。另外，個(gè)別鞘脂在某些時(shí)點(diǎn)有所降低，如(m/z)508.9和657.4在1

9、2小時(shí)與對(duì)照組相比有所降低。對(duì)于有顯著改變的峰，根據(jù)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院建立的小型的鞘脂類(lèi)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了對(duì)比，對(duì)它們可能的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測(cè)。 3、對(duì)鞘脂代謝中的兩個(gè)關(guān)鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)和酸性鞘磷脂酶(ASM)的基因表達(dá)情況進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示SPT和ASM在再灌注后損傷后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照相比均無(wú)顯著性差異。提示再灌注后鞘脂的代謝可能通過(guò)影響關(guān)鍵酶的活性來(lái)改變鞘脂的代謝。 結(jié)論: 一、脂類(lèi)組學(xué)

10、的分析方法基質(zhì)輔助激光解離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)能有效的分析肝臟組織中各類(lèi)鞘脂的代謝變化，為脂類(lèi)組學(xué)在肝臟疾病中的研究提供了有力的技術(shù)支持。 二、缺血再灌注后，肝臟鞘脂代謝發(fā)生顯著改變，三類(lèi)鞘脂：神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺單己糖苷再灌注后均明顯增加。這三類(lèi)鞘脂在再灌注后的變化與肝臟損傷程度一致，提示與肝臟缺血再灌注損傷相關(guān)。 三、肝臟缺血再灌注后鞘脂代謝的關(guān)鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶和酸性鞘磷脂酶的基