細胞凋亡與自體吞噬在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究.pdf

1、目的：探討大鼠肝臟缺血再灌注損傷過程中細胞凋亡和自體吞噬的作用。
　　 方法：采用雄性SD大鼠,建立大鼠肝臟部分缺血再灌注模型,隨機分為正常假手術(shù)組(N組;n=10),缺血30分鐘再灌注組(S組;n=40)、缺血60分鐘再灌注組(L組;n=40),后兩組分別于再灌注0點、3小時、24小時、48小時設計4個觀察點(A、B、C、D點),每組10只大鼠。采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALT和AST的活性。肝臟組織HE染色后于×40

2、0倍的光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測相關細胞因子TNF、IL-8、IL-2的變化情況。TUNEL染色觀察細胞凋亡并計算調(diào)亡指數(shù),鏡下記數(shù)時,每個標本觀察4張切片;每張切片隨機選擇10個視野,先在低倍顯微鏡下統(tǒng)計該視野中的細胞總數(shù)并找出被標記的細胞,然后經(jīng)高倍顯微鏡(×400倍)下計數(shù)每張切片凋亡陽性細胞核數(shù)目及其與總細胞核數(shù)目比例,取其平均值為細胞凋亡指數(shù)(APOⅠ)。采用Western-Blot方法對

3、自體吞噬(簡稱自噬)進行半定量分析,蛋白條帶用Totallab軟件(2.01版)檢測,以IOD值(積分光密度值)代表蛋白表達的強度,以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白(GADPH)的IOD比值作為目的蛋白表達水平的參數(shù),用目的蛋白的表達量來反映自噬反應情況。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗,兩組計量資料間比較用T檢驗,三組計量資料間比較用方差分析,計數(shù)資料間比較行卡方檢驗。P值＜0.05認為有統(tǒng)計學差異,所有統(tǒng)計分析均使用正版SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件完

4、成。
　　 結(jié)果：組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn):在肝臟缺血再灌注損傷過程中,隨著時間的延長,肝組織損傷逐漸加重,再灌注24小時后達到高峰,而再灌注48小時后開始出現(xiàn)肝細胞的增殖修復。缺血60分鐘手術(shù)組較缺血30分鐘組肝臟損傷普遍嚴重。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn):在肝臟缺血再灌注損傷過程中,有明顯的細胞凋亡和自噬現(xiàn)象。在缺血再灌注3小時后,即可觀察到細胞凋亡,并隨時間推移而逐步增加。自噬現(xiàn)象出現(xiàn)較細胞凋亡為早,缺血30分鐘手術(shù)組和缺血60分鐘手術(shù)組存在

5、明顯差異,其中缺血30分鐘手術(shù)組自噬更為活躍,再灌注3小時后自噬最明顯,而再灌注24小時后自噬則明顯減少,但再灌注48小時后又可以觀察到自噬情況有所恢復。肝缺血再灌注發(fā)生后兩組ALT、AST、TNF、IL-8、IL-2檢測結(jié)果皆升高,并隨時間推移而進一步增高,缺血30分鐘手術(shù)組ALT、AST結(jié)果峰值出現(xiàn)于術(shù)后3小時,而后ALT、AST檢測結(jié)果呈逐步減低,缺血60分鐘手術(shù)組ALT、AST峰值出現(xiàn)于術(shù)后24小時,而在術(shù)后48小時兩組ALT、

6、AST檢測結(jié)果皆較前有明顯減低。兩組TNF、IL-8、IL-2監(jiān)測結(jié)果峰值皆出現(xiàn)于缺血發(fā)生后3小時,隨后TNF、IL-8、IL-2檢測結(jié)果逐步減低。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后不同時間點凋亡指數(shù)均較對照組增高,其差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后凋亡指數(shù)隨時間變化而增高,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),同一時間點缺血30分鐘組凋亡指數(shù)均較缺血60分鐘組凋亡指數(shù)減低,其差異均具有統(tǒng)計學意義

7、(p＜0.01)。缺血30、60分鐘手術(shù)組不同時間點凋亡指數(shù)與相同時間點ALT、AST、IL-8、TNF及IL-2檢測結(jié)果均無明顯相關性(p＞0.05)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后不同時間點LC3檢測均較對照組增高,其差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后LC3隨時間變化而增高,其峰值均出現(xiàn)于術(shù)后3小時,而后均隨時間推移而明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01),同一時間點缺血30分鐘組L

8、C3均較缺血60分鐘組LC3升高,其差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。缺血再灌注30分鐘組LC3隨時間變化與ALT、AST、IL-2相關性檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學意義,相關系數(shù)分別為0.6732(p＜0.01);0.5715(p＜0.05);0.7548(p＜0.01)。缺血再灌注60分鐘組LC3隨時間變化與AST、IL-8、IL-2相關性檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學意義,相關系數(shù)分別為0.5050(p＜0.05);0.7542(p＜0.01);0