維甲酸誘導(dǎo)Ⅰ在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制.pdf

1、缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的概念由Jennings于1960年首次提出，指缺血的組織器官重新獲得血液供應(yīng)后，組織、器官功能并沒有得以恢復(fù)，其功能代謝障礙及組織結(jié)構(gòu)破壞程度反而加重的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷是常見的臨床病理現(xiàn)象，涉及機(jī)體創(chuàng)傷與失血性休克、心臟冠狀動(dòng)脈缺血、心臟體外循環(huán)手術(shù)、肝臟部分切除術(shù)以及肝、腎臟等器官移植手術(shù)等，可嚴(yán)重影響疾病的預(yù)后，但由于對(duì)IRI發(fā)生的分子機(jī)制仍然缺乏

2、深刻的了解，限制了臨床防治方法的有效實(shí)施。特別是肝、腎、心臟等臟器移植過(guò)程中器官的獲取和移植過(guò)程中產(chǎn)生的IR損傷可導(dǎo)致移植物無(wú)功能或功能延遲恢復(fù)，并增加移植物急、慢性排斥的發(fā)生率，影響移植物的中遠(yuǎn)期存活率，因此，如何有效的減輕IR損傷，以及更好的保護(hù)供體器官，都是亟待解決的研究課題。IR損傷的機(jī)制復(fù)雜，分為缺血、再灌注二個(gè)過(guò)程;缺血過(guò)程中由于缺氧后線粒體功能受損及ATP耗竭，造成能量代謝障礙、鈣超載以及細(xì)胞凋亡等為主的損傷;再灌注后主要

3、涉及到氧自由基釋放造成蛋白和核酸的損傷，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及凋亡損傷的進(jìn)一步加重。近年來(lái)，隨著天然免疫產(chǎn)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，模式識(shí)別受體(Patternrecognition receptors，PRRs)對(duì)病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecularpattern，PAMP)識(shí)別機(jī)制也適用于對(duì)損傷相關(guān)的分子模式(DMAP: damge associatedmolecule pattern)的識(shí)別，從而認(rèn)識(shí)到在肝臟

4、IR過(guò)程中，缺血缺氧所致的直接損傷使受損細(xì)胞釋放內(nèi)源性配體或危險(xiǎn)信號(hào)(HMGB-1、HSP、尿酸、纖維蛋白原等)，激活肝細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體，從而啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)，介導(dǎo)進(jìn)一步的損傷。由此可見，模式識(shí)別受體及其信號(hào)通路在肝臟IR的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。然而，前期研究均集中在Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和相關(guān)的信號(hào)通路，而另一種重要的模式識(shí)別受體: RLRs(Retinoic-acid-

5、inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-likereceptors，RLRs）是否在肝臟IR損傷過(guò)程中也發(fā)揮作用并未受到關(guān)注。研究表明，RLRs所介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)在機(jī)體抵抗病毒感染的天然免疫過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，其中又以維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（Retinoic-acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ）為最具代表性的分子，其是否在肝臟IR損傷過(guò)程中發(fā)揮作用以及如何發(fā)揮作用的機(jī)制值得探究。
　　 RIG-Ⅰ又稱DDX

6、58A，包含925個(gè)氨基酸殘基，屬于DExD/H家族，主要分布在胞質(zhì)中。RIG-Ⅰ主要識(shí)別并直接結(jié)合5'端磷酸化的病毒RNA，與其受體MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)、IPS-1(IFN-βpromoter stimulator1)或Cardif（CARD adaptor inducing IFN-β）結(jié)合，通過(guò)活化NF-κB和IRF3/7，引起Ⅰ型干擾素分泌上調(diào)，介導(dǎo)抗病毒

7、免疫應(yīng)答。然而，機(jī)體自身表達(dá)的RNA最初也有5'端的磷酸化修飾，盡管在正常情況下機(jī)體自身來(lái)源的RNA均不會(huì)在胞漿中激活RIG-Ⅰ信號(hào)。但是，當(dāng)細(xì)胞壞死釋放核內(nèi)物質(zhì)的時(shí)候，其中是否包括RIG-Ⅰ的配體？RIG-Ⅰ信號(hào)通路是否也如同TLRs一樣參與肝臟IR的介導(dǎo)？目前尚無(wú)相關(guān)的研究報(bào)道。
　　 基于此，我們?cè)诒菊n題中研究了RIG-Ⅰ與肝臟IR之間的相互關(guān)系及其對(duì)肝臟IR損傷調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。
　　 一、肝臟IR對(duì)RIG-Ⅰ表達(dá)

8、的影響及可能機(jī)制
　　 為了探討肝臟IR對(duì)RIG-Ⅰ表達(dá)的影響，我們采用小鼠部分肝臟IR模型(70％)，觀察IR后小鼠肝臟內(nèi)RIG-Ⅰ的表達(dá)。小鼠缺血60min后，取再灌注（血流開放）后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟組織，western-blot檢測(cè)IR后RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示IR之后，肝組織RIG-Ⅰ的表達(dá)出現(xiàn)短時(shí)間的降低，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，RIG-Ⅰ表達(dá)逐漸升高，免疫組化結(jié)果也證實(shí)IR后24h肝組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的細(xì)胞核周圍

9、可見RIG-Ⅰ蛋白DAB染色增多。
　　 隨后，我們進(jìn)一步分析了RIG-Ⅰ表達(dá)變化主要發(fā)生在何種細(xì)胞。我們?cè)贗R后不同時(shí)間，采用兩步法分離出小鼠的肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，分別對(duì)其RIG-Ⅰ的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，肝臟IR后RIG-Ⅰ在肝細(xì)胞中有表達(dá)變化顯著，在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中無(wú)明顯變化，提示肝臟IR主要影響肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的RIG-Ⅰ表達(dá)。
　　 我們?cè)龠M(jìn)一步探討了肝臟IR影響RIG-Ⅰ表達(dá)的機(jī)制。由于RIG-Ⅰ上調(diào)的原因較

10、多，可以由IR后期產(chǎn)生的各種炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)，我們主要關(guān)注在IR早期的RIG-Ⅰ下調(diào)現(xiàn)象。我們首先分析了IR過(guò)程中必然存在的氧化應(yīng)激在其中的作用，采用體外H2O2刺激新鮮分離的肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H2O2呈劑量和時(shí)間依賴性下調(diào)肝細(xì)胞中RIG-Ⅰ表達(dá)，而對(duì)非實(shí)質(zhì)RIG-Ⅰ表達(dá)基本無(wú)作用，證實(shí)在肝臟IR后早期是氧化應(yīng)激作為誘因?qū)Ω闻K實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。根據(jù)RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)下調(diào)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)特性，我們推測(cè)可能與現(xiàn)存蛋白的降解增加有關(guān)。因此，

11、我們采用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理新鮮分離出的肝細(xì)胞，之后再進(jìn)行H2O2刺激，發(fā)現(xiàn)IR后RIG-Ⅰ的下調(diào)得到抑制，提示肝臟IR后RIG-Ⅰ下調(diào)的直接機(jī)制可能與泛素蛋白酶體通路活化所致的蛋白降解有關(guān)。
　　 二、 RIG-Ⅰ在肝臟IR損傷中的作用
　　 肝臟IR后RIG-Ⅰ表達(dá)的變化提示RIG-Ⅰ可能參與肝臟IR這一病理生理過(guò)程。在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們采用了RIG-Ⅰ缺陷的小鼠來(lái)探討RIG-Ⅰ信號(hào)通路在肝臟IR中的具體作

12、用。首先生化分析結(jié)果顯示RIG-Ⅰ缺陷小鼠在肝臟IR后肝功能指標(biāo)（轉(zhuǎn)氨酶水平）升高幅度顯著低于同窩對(duì)照的野生型小鼠，提示RIG-Ⅰ缺陷能明顯減輕肝臟IR損傷。肝組織病理分析顯示，同窩對(duì)照的野生型小鼠在IR后24小時(shí)肝細(xì)胞大量凋亡，壞死區(qū)域明顯，而RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理?yè)p傷程度明顯降低，suzuki's病理評(píng)分也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。
　　 隨后，我們研究了RIG-Ⅰ缺陷之后的這種損傷減輕與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，采用免疫組化檢測(cè)巨噬細(xì)胞

13、(F4/80)的浸潤(rùn)，結(jié)果顯示在RIG-Ⅰ缺陷小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低，而進(jìn)一步的結(jié)果表明其肝臟IR后炎癥因子的產(chǎn)生均較野生型小鼠顯著減低。凋亡與IR之間的關(guān)系密不可分，采用TUNEL法檢測(cè)肝組織凋亡，我們發(fā)現(xiàn)與同窩野生型小鼠組相比，RIG-Ⅰ缺陷也能明顯減輕肝細(xì)胞的凋亡，這就為RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理?yè)p傷程度較輕進(jìn)一步提供了證據(jù)。
　　 我們進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建骨髓嵌合小鼠以確定實(shí)質(zhì)細(xì)胞還是非實(shí)質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的RIG-Ⅰ在肝臟IR中發(fā)

14、揮作用，通過(guò)檢測(cè)嵌合小鼠IR后轉(zhuǎn)氨酶的水平發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺陷RIG-Ⅰ和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺陷RIG-Ⅰ小鼠的肝功能無(wú)明顯差異，但都低于野生型小鼠，說(shuō)明實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的RIG-Ⅰ都參與介導(dǎo)肝臟IR損傷，但由于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞占據(jù)肝臟細(xì)胞的絕大多數(shù)，且肝細(xì)胞的RIG-Ⅰ表達(dá)可以受IR調(diào)控，因此，在接下來(lái)的研究中，我們重點(diǎn)關(guān)注肝細(xì)胞的RIG-Ⅰ信號(hào)通路如何參與肝臟IR的進(jìn)程。
　　 三、肝細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路通過(guò)促凋亡途徑而致肝臟IR損傷

15、r>　　 RIG-Ⅰ作為RLRs家族的重要成員，其所介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)在機(jī)體抵抗病毒感染的天然免疫過(guò)程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。RIG-Ⅰ信號(hào)通路的活化不僅能夠促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，也能啟動(dòng)干擾素產(chǎn)生非依賴的促凋亡信號(hào)。已有報(bào)道表明在人的黑色素瘤細(xì)胞中，RIG-Ⅰ信號(hào)的觸發(fā)可導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞凋亡，但RIG-Ⅰ信號(hào)通路是否也參與介導(dǎo)肝臟IR后的凋亡，目前尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。鑒于凋亡是肝臟IR致?lián)p傷的關(guān)鍵機(jī)制之一，我們假設(shè)，RIG-Ⅰ信號(hào)通路增強(qiáng)肝臟I

16、R所致的損傷可能與通過(guò)促進(jìn)肝臟IR誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。
　　 首先，我們采用western blot檢測(cè)了RIG-Ⅰ缺陷及野生小鼠在肝臟IR后早期caspase3、caspase8的活化情況，結(jié)果顯示，IR后RIG-Ⅰ缺陷小鼠肝組織中上述凋亡相關(guān)酶的活化顯著降低，提示RIG-Ⅰ信號(hào)通路與肝臟IR后的凋亡過(guò)程相關(guān)。我們進(jìn)一步采用免疫共沉淀的方法證明了RIG-Ⅰ與caspase8二者存在直接的相互作用。
　　 為進(jìn)一步研究在IR

17、過(guò)程中肝細(xì)胞的RIG-Ⅰ是如何得到活化，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):將IR后的肝組織勻漿作為刺激物，分別對(duì)新鮮分離出的野生和RIG-Ⅰ缺陷的肝細(xì)胞刺激，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)IFN-β的表達(dá)、western blot檢測(cè)IRF3的磷酸化水平，以及測(cè)定肝細(xì)胞凋亡情況等手段，檢測(cè)勻漿刺激對(duì)RIG-Ⅰ信號(hào)通路的活化情況。結(jié)果顯示:在野生肝細(xì)胞，IR后的肝組織勻漿可以促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生，同時(shí)也介導(dǎo)凋亡，而在RIG-Ⅰ缺陷肝細(xì)胞，上述過(guò)程受到顯著的抑制。

18、由此我們認(rèn)為IR后的肝組織勻漿具有激活RIG-Ⅰ信號(hào)通路的作用。
　　 我們?cè)诘诙糠盅芯恐幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)，IR的肝組織勻漿中含有明顯升高的TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)RIG-Ⅰ信號(hào)通路可能存在一定的調(diào)節(jié)作用。此外，肝組織勻漿的制備過(guò)程中也必定會(huì)混入正常細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)，可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，我們借鑒文獻(xiàn)方法，制備了肝細(xì)胞以及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的壞死上清，作為條件培養(yǎng)基與新鮮分離的野生和RIG-Ⅰ-/-的肝細(xì)胞共孵育，并通

19、過(guò)流式檢測(cè)受刺激后肝細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果提示肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中存在可以激活RIG-Ⅰ信號(hào)通路的物質(zhì)。為了進(jìn)一步明確激活RIG-Ⅰ信號(hào)的配體，我們檢測(cè)了壞死上清內(nèi)的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS含量在肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的壞死上清中均較高，炎癥因子TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)水平在壞死上清中無(wú)明顯改變，IL-6的蛋白水平在肝細(xì)胞壞死上清中輕度升高。隨后，我們采用H2O2作為ROS直接刺激新鮮分離的野生及RIG-Ⅰ-/-的肝細(xì)胞，并檢測(cè)刺激后IF

20、N-β的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ缺陷并未引起IFN-β的表達(dá)改變，提示ROS本身并不能激活RIG-Ⅰ信號(hào)通路。因此，我們推測(cè)可能是IR后受損的肝細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，包括RNA等物質(zhì)，激活肝細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路，進(jìn)而通過(guò)促凋亡途徑而導(dǎo)致肝臟IR損傷。
　　 結(jié)合上述三部分的研究，我們得出結(jié)論，RIG-Ⅰ對(duì)肝臟IR后的損傷效應(yīng)呈正相促進(jìn)作用。肝臟IR后早期因氧化應(yīng)激導(dǎo)致RIG-Ⅰ表達(dá)下調(diào)，其直接原因是泛素蛋