NALP3炎癥小體參與小鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制.pdf

1、缺血再灌注過(guò)程可釋放多種激活炎癥小體的啟動(dòng)因子，故推測(cè)炎癥小體可能參與缺血再灌注損傷。文獻(xiàn)已報(bào)道：炎癥小體激活所釋放IL-1β和IL-18在小鼠LIRI中是重要的啟動(dòng)因子，某些針對(duì)IL-1β和IL-18的治療策略顯示較好療效；IL-1β在缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β基因敲除小鼠能明顯減緩缺血再灌注損傷；IL-1受體拮抗基因敲除小鼠缺血再灌注損傷明顯加重。本課題建立小鼠LIRI動(dòng)物模型，并構(gòu)建針對(duì)小鼠NALP3的干擾質(zhì)粒，觀察

2、NALP3炎癥小體參與LIRI的作用，并初步探討其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NALP3炎癥小體在小鼠肝臟缺血再灌注所致無(wú)菌性炎癥及組織損傷中起重要作用，其機(jī)制為：NALP3炎癥小體參與IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子成熟、釋放；NALP3炎癥小體參與肝臟細(xì)胞凋亡及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本課題所獲研究成果為臨床上探索防治LIRI的策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、NALP3炎癥小體參與小鼠LIRI 建立雄性C57/BL小鼠LIRI模型，同時(shí)設(shè)立假

3、手術(shù)對(duì)照組。 1.小鼠LIR后血清ALT/AST變化及肝臟形態(tài)學(xué)改變小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后收集血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）變化，同時(shí)制作肝臟石蠟切片，H&E染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：模型組ALT/AST明顯高于假手術(shù)組，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性、凋亡、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型制作成功。2.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β水平分別采集小鼠肝臟缺血1h再灌注1h、3h、

4、6h及24h后血樣，ELISA檢測(cè)IL-1β水平。結(jié)果顯示：與假手術(shù)對(duì)照組相比，血清IL-1β在1h后開(kāi)始升高，6h達(dá)高峰，24h后回落至1h水平(p<0.05)。3.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)NALP3蛋白表達(dá)小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后分別取小鼠肝臟組織，免疫印記與IL-1β大量釋放相關(guān)。缺血再灌注過(guò)程可釋放多種激活炎癥小體的啟動(dòng)因子，如鈣聚集、鉀離子外流、ROS及多種危險(xiǎn)信號(hào)（如HMGB1、DNA及RNA）等，故推測(cè)炎

5、癥小體可能參與缺血再灌注損傷。文獻(xiàn)已報(bào)道：炎癥小體激活所釋放IL-1β和IL-18在小鼠LIRI中是重要的啟動(dòng)因子，某些針對(duì)IL-1β和IL-18的治療策略顯示較好療效；IL-1β在缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β基因敲除小鼠能明顯減緩缺血再灌注損傷；IL-1受體拮抗基因敲除小鼠缺血再灌注損傷明顯加重。迄今，有關(guān)NALP3炎癥小體是否參與肝臟缺血再灌注損傷，以及干預(yù)NALP3對(duì)小鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響，均尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題建

6、立小鼠LIRI動(dòng)物模型，并構(gòu)建針對(duì)小鼠NALP3的干擾質(zhì)粒，觀察NALP3炎癥小體參與LIRI的作用，并初步探討其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NALP3炎癥小體在小鼠肝臟缺血再灌注所致無(wú)菌性炎癥及組織損傷中起重要作用，其機(jī)制為：NALP3炎癥小體參與IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子成熟、釋放；NALP3炎癥小體參與肝臟細(xì)胞凋亡及。
　　 本課題所獲研究成果為臨床上探索防治LIRI的策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、NALP3炎癥小

7、體參與小鼠LIRI 建立雄性C57/BL小鼠LIRI模型，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)對(duì)照組。
　　 1.小鼠LIR后血清ALT/AST變化及肝臟形態(tài)學(xué)改變小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后收集血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）變化，同時(shí)制作肝臟石蠟切片，H&E染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：模型組ALT/AST明顯高于假手術(shù)組，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性、凋亡、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型制作成功。

8、2.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β水平分別采集小鼠肝臟缺血1h再灌注1h、3h、6h及24h后血樣，ELISA檢測(cè)IL-1β水平。結(jié)果顯示：與假手術(shù)對(duì)照組相比，血清IL-1β在1h后開(kāi)始升高，6h達(dá)高峰，24h后回落至1h水平(p<0.05)。3.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)NALP3蛋白表達(dá)小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后分別取小鼠肝臟組織，免疫印記法檢測(cè)NALP3蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組對(duì)照，小鼠缺血1h再灌注后NAL

9、P3蛋白開(kāi)始上調(diào)，持續(xù)到12h，以6h最為明顯(p<0.05)。4.小鼠肝臟缺血再灌注損傷后ROS變化小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后分離非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，DCF染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS含量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，缺血1h再灌注6h后ROS明顯增高。以上結(jié)果提示，NALP3炎癥小體參與小鼠LIRI過(guò)程。
　　 二、NALP3基因干擾載體的構(gòu)建及鑒定
　　 1.針對(duì)小鼠NALP3基因干擾序列的篩選利用siRNA設(shè)計(jì)軟件篩選

10、針對(duì)小鼠NALP3基因的3條干擾序列及1條無(wú)關(guān)序列，分別合成并命名為siRNA1(S1)，siRNA2(S2)，siRNA3(S3)及scramble siRNA，利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)目的蛋白NALP3沉默效果，發(fā)現(xiàn)siRNA3沉默效果最佳，scramble siRNA無(wú)明顯影響。故選擇siRNA3序列為NALP3有效干擾序列。2.特異性pNALP3shRNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定分別將siR

11、NA3特異性干擾序列及scramble siRNA無(wú)關(guān)序列構(gòu)建入干擾載體pNALP3shRNA及pshRNANC中，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證其正確性。利用小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)試劑盒分別轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA和pshRNANC至巨噬細(xì)胞，設(shè)立mock組對(duì)照。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NALP3 mRNA水平，Western blot檢測(cè)其蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pNALP3shRNA干擾載體能特異性沉默NALP3基因 (p<0.05)，而對(duì)其他相關(guān)基

12、因（NALP1b、NLRC4等）無(wú)影響。提示pNALP3shRNA干擾載體具有沉默特異性。3.pNALP3shRNA干擾載體對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的影響利用小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)試劑盒轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA和pshRNANC至巨噬細(xì)胞，設(shè)mock組對(duì)照。48h后繼續(xù)給予LPS及ATP刺激，檢測(cè)上清IL-1β含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA組IL-1β含量明顯降低 (p<0.05)。
　　 三、沉默NALP3基因?qū)π∈驦

13、IRI的影響及其機(jī)制
　　 1.體內(nèi)干擾NALP3基因?qū)π∈驦IRI的保護(hù)作用（1）pNALP3shRNA對(duì)小鼠肝臟的沉默效果尾靜脈高壓注射pNALP3shRNA質(zhì)粒后48h，制作小鼠缺血1h再灌注6h動(dòng)脈模型，實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝組織NALP3表達(dá)。結(jié)果表明：與生理鹽水及pshRNANC組相比，pNALP3shRNA組NALP3表達(dá)明顯下降；免疫組化顯示NALP3主要表達(dá)于肝臟K

14、upffer細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Kupffer細(xì)胞和肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞NALP3表達(dá)均被抑制。（2）pNALP3shRNA預(yù)處理對(duì)小鼠缺血再灌注損傷后肝功能的影響小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后收集血清及肝組織制作切片。檢測(cè)ALT/AST水平及H&E染色。
　　 結(jié)果表明：與生理鹽水及pshRNANC對(duì)照組相比，pNALP3shRNA組血清ALT/AST水平明顯降低 (p<0.01)，H&E染色顯示肝

15、細(xì)胞變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。提示pNALP3shRNA預(yù)處理小鼠能明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷。2.沉默NALP3基因?qū)π∈驦IRI保護(hù)作用的可能機(jī)制（1）pNALP3shRNA預(yù)處理對(duì)小鼠LIRI后血清IL-1β、IL-18水平的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，血清IL-1β和IL-18水平均升高；pNALP3shRNA預(yù)處理能明顯降低血清IL-1β和IL-18水平 (p<0.05)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pNALP3s

16、hRNA預(yù)處理能降低活化的Caspase-1水平。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，pNALP3-shRNA能抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-1β(p<0.05)。（2）pNALP3shRNA對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子及HMGB1水平的影響與生理鹽水及pshRNANC對(duì)照組相比，pNALP3shRNA預(yù)處理組小鼠缺血1h再灌注6h后血清TNF-α和IL-6水平明顯減低，同時(shí)肝組織HMGB1表達(dá)明顯降低 (p<0.05)。再灌注后1h提取肝臟核蛋白，凝膠遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)

17、檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，結(jié)果顯示，pNALP3shRNA組NF-κB活性明顯減低(p<0.05)。（3）pNALP3shRNA對(duì)小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，切取肝組織，4％多聚甲醛固定，制作石蠟切片，TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組及pshRNANC組對(duì)比，pNALP3shRNA預(yù)處理能明顯減輕小鼠缺血1h再灌注6h后肝細(xì)胞凋亡(p<0.05)。（4）pNALP3shRNA對(duì)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞及

18、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，切取肝組織，4％多聚甲醛固定，制作石蠟切片，免疫組化檢測(cè)巨噬細(xì)胞(F4/80)和中性粒細(xì)胞(Gr-1)浸潤(rùn)。
　　 四、結(jié)論
　　 1.NALP3 炎癥小體參與小鼠LIRI發(fā)生、發(fā)展。2.pNALP3shRNA預(yù)處理能保護(hù)小鼠肝臟缺血再灌注損傷。3.上述保護(hù)作用的可能機(jī)制為：抑制炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6及HMGB1釋放；抑制NF-κB活性；減少肝細(xì)